FLT3靶向RNA干擾的抗白血病效應及NF-κB通路、SMRT在FLT3信號傳導中的作用.pdf

1、急性髓細胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia，AML)是造血系統(tǒng)的惡性侵襲性疾病，盡管誘導化療能使70％以上的患者獲得臨床緩解，但大部分之后復發(fā)，AM[，患者長期存活率只在40％左右，更有效的治療策略急待開發(fā)。 FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)KT3)是Ⅲ型受體酪氨酸激酶(RTK)受體家族的成員，在骨髓中主要表達在CD34<'+>的造血干/祖細胞及樹突狀前體細

2、胞上，配體介導的FLT3活化在造血原始細胞的增殖、分化中有重要的作用。然而超過70％的AML細胞表面表達有野生型FLT3、25～35％的表達有突變型FLT3，包括30％左右的FLT3近膜結構域短串聯(lián)重復突變(FLT3-ITD)和7％的酪氨酸激活結構域點突變(FLT3-TDK)。FLT3異常表達和患者的臨床白細胞增多癥、預后差密切相關。 FLT3作為AML治療極有前景的分子靶標深受關注。目前已開發(fā)了幾種FLT3抑制劑，但Ⅰ、Ⅱ期臨

3、床實驗的結果不令人滿意。首先沒有一種抑制劑是真正FLT3特異性的，它們也可識別VEGF、c-KIT、FMS及PDGF等受體，臨床毒副作用不可避免；另外FLT3-TDK各種點突變引發(fā)FLT3結構的細微變化，也導致了某些FLT3抑制劑的耐藥問題。更重要的是AML的發(fā)病具多基因突變累加的特點，相關基因的研究遠未完善；研究證實FLT3信號傳導涉及許多中介分子，但大多數(shù)在此信號級聯(lián)中的地位和作用還不清楚，進一步闡明FLT3與其它分子相互作用的機制

4、，F(xiàn)LT3異常激活引發(fā)的下游信號途徑，將為FLT3靶向治療研究提供新的視野。 RNA干擾是FLT3靶向抑制的另一策略，它不僅為FLT3功能學研究提供了強有力的工具，也是AML極有前景的基因治療手段。本研究中首先設計、合成了3條FLT3靶向的短發(fā)夾狀干擾RNA(FLT3-shRNA)，通過轉染FLT3過表達的AML細胞株，評價其抑制效應，篩選出效率高的1條；隨后體外實驗中探討了FLT3表達的下調對THP-1、HL-60細胞增殖，凋

5、亡的作用。目前對FLT3信號傳導的研究，野生型主要集中在P13K-AKT、RAS-MAPK、SRC通路上，ITD突變型還包括STAT5通路，對在AML發(fā)生、發(fā)展中有重要作用的核因子кB(Nuclear Factor Kappa B，NF-кB)通路、輔抑制子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(Silencing Medtiator for Retinoic Acid and Thyroid Hormone Receptor，SMRT)，研究還少

6、有涉及。 NF-кB是一類核內轉錄因子，它通過調節(jié)cyclinD1，c-myc，Bcl-2等基因的轉錄，可正性調節(jié)細胞增殖、凋亡等過程；SMRT是真核生物基因轉錄抑制調節(jié)的基本成分，因此作者通過RNA干擾的方法下調FLT3表達，探討NF-кB通路、SMRT在FLT3信號傳遞中的可能作用。并通過建立THP-1白血病細胞Nu/Nu皮下移植瘤模型，體內實驗觀察FLT3-shRNA干擾單獨，或與NF-кB抑制劑Parthenolide(

7、PN)、柔紅霉素(Daunorubicin，DNR)聯(lián)合作用時的抗白血病效應。 第一部分五種髓細胞白血病細胞株FLT3表達及FLT3-ITD方法突變的研究 1．對5種髓細胞白血病細胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01，以RT-PCR法檢測細胞FLT3 mRNA的表達。 2．FLT3在細胞中有胞漿蛋白和跨膜蛋白兩種存在形式，F(xiàn)LT3跨膜蛋白是其活性形式。以Western blotting檢測

8、FLT3總蛋白的表達，以流式細胞術(FCM)法檢測FLT3跨膜蛋白的表達。 3．鑒于FLT3-ITD突變型與其它類型的FLT3受體激活方式、信號傳導途徑都有不同，提取各細胞基因組DNA，PCR擴增其易發(fā)生ITD突變的近膜區(qū)序列，PCR產物連入T-載體并測序，檢測是否存在FLT3-ITD突變。 第二部分 FLT3靶向短發(fā)夾狀干擾RNA體外轉錄合成、篩選及作用 方法 1．設計、體外轉錄合成3條FLT3-shR

9、NA、1條陰性對照shRNA(NC-shRNA)，確定其濃度。 2．用25nM的3種FLT3-shRNA、NC-shRNA轉染THP-1細胞，24h、48h及72h分別收獲細胞，RT-PCR法檢測各組FLT3 mRNA的表達，以GAPDH作內參計算其mRNA的相對含量，初步確定各shRNA的干擾效率。 3．將對mRNA抑制效率較高的FLT3-shRNA1，以5nM、10nM、15nM、20nM、25nM濃度轉染THP-1

10、細胞，48h收獲細胞測FLT3 mRNA，評價濃度效應關系。 4．將對mRNA抑制效率達50％以上的FLT3-shRNA1、shRNA3轉染THP-1細胞，48h、72h收獲細胞，以FCM測FLT3跨膜蛋白的表達，72h以Western blotting測FLT3總蛋白的表達。 5．根據(jù)上述結果，用15nM的FLT3-shRNA1轉染HL-60細胞，48h以RT-PCR測FLT3 mRNA表達，72h以FCM、Weste

11、rn blotting測FLT3蛋白的表達。 第三部分 FLT3靶向RNA干擾抑制THP-1、HL-60細胞增殖、促進凋亡的實驗研究 方法 以下試驗均設PBS對照組FLT3-shRNAi組，NC-shRNA組及，分別轉染以15nM的FLT3-shRNAl、NC-shRNA，或處理以同體積數(shù)的PBS。 1. 96孔板中THP-1、HL-60細胞以4×10<'4>/ml密度轉染FLT3-shRNA1，培養(yǎng)8天

12、，每天取3孔加入CCK-8，測定細胞增殖活力并繪制增殖曲線。細胞再以4×10<'5>/ml密度轉染，24h、48h、72h測定增殖活力并計算增殖抑制率。 2．如上述處理細胞，48h各組細胞經(jīng)PI染色，用FCM法測定細胞周期分布。 3．轉染48h分別以Annexin V-FITC法、DNA Ladder法檢測THP-1、HL-60細胞凋亡狀況，另THP-1細胞以TUNEL原位酶標記法檢測凋亡。 4．轉染48h和72

13、h，用RT-PCR法檢測eyelin D1、eyelin A的mRNA表達；提取細胞總蛋白，用Western blotting檢測其蛋白表達。 第四部分 NF-кB通路、核輔抑制子SMRT在FLT3信號傳遞中的作用 方法： 1．THP-1細胞株中用RT-PCR檢測NF-кB家族的P65、阻遏物IкB mRNA的表達，用免疫組化、Western blotting法檢測其蛋白的表達。 2．96孔板中用0μM～

14、20nM范圍內的系列濃度的NF-кB抑制劑Parthenolide(PN)，處理4×10<'5>/ml密度的THP-1細胞，12h、24h用CCK-8法檢測細胞增殖活力，計算細胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)。后根據(jù)上述結果，用6μM的PN作用于4×10<'4>/ml密度的THP-1細胞，共培養(yǎng)6天，繪制細胞增殖曲線。 3．試驗共分5組，分別處理以PBS、NC-shRNA、FLT3-shRNAi、Phi及FLT3-shRNA

15、i+PN，轉染組均轉以15nM的shRNA，作用終時間48h；PN組處理以6gM的PN，作用終時間24h。各組細胞收獲后，用RT-PCR檢測P65、IкB、cyclinD1及SMRTmRNA的表達：用Western blotting檢測細胞總蛋白、核蛋白的表達。 4．FLT3-shRNA1轉染細胞48h，分別處理以系列濃度的PN，12h、24h用CCK-8法檢測細胞增殖活力，計算IC<,50>。 5．THP-1細胞分別處

16、理以PBS、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi+PN，細胞收獲后以FCM檢測細胞周期分布，以Annexin VFITC法檢測細胞凋亡。 第五部分 Nu/Nu裸鼠移植瘤模型建立及FLT3靶向RNA干擾體內抗白血病的效應方法 1．指數(shù)生長期的THP．-細胞，以1×10<'7>/只劑量接種到Nu/Nu裸鼠右腋皮下，建立THP-1細胞裸鼠皮下移植瘤模型。 2．當THP-1移植瘤體積長到100～300mm

17、<'3>，隨機分6組，5只/組，各組按既定方案腹腔注射給藥，分別處理以PBS(1組)、FLT3-shRNAi(2組)、PN(3組)、shRNAi+PN(4組)、柔紅霉素(DNR，5組)、shRNAi+DNR(6組)，總計15天。 3．隔日測瘤體積，裸鼠體重；實驗結束時處死小鼠稱瘤重，計算抑瘤率。 4．對取出的瘤組織，用TUNEL檢測瘤細胞凋亡，用免疫組化、RT-PCR、WesternbloRing分別檢測FLT3、P65