mTORC1相關基因功能性多態(tài)位點與前列腺癌易感性及預后關系的分子流行病學研究.pdf

1、前列腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病具有顯著的地區(qū)及種族差異。中國前列腺癌的發(fā)病率也有逐年升高的趨勢。越來越多的證據(jù)表明，年齡、種族和家族史是目前公認的與前列腺癌發(fā)病相關的三大因素。前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能是機體遺傳易感性和環(huán)境因素相互作用的結果，而與此相關的遺傳變異則決定個體罹患前列腺癌的易感性。迄今為止，在世界上不同種族人群中的全基因組關聯(lián)性研究已經(jīng)揭示了超過30個易感位點與前列腺癌的發(fā)生風險有關。以候選基因為策略的前列腺癌

2、遺傳易感性的研究也取得了豐碩的成果。目前認為，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其預后與遺傳物質的多態(tài)性相關，而且這種相關性隨著高危易感基因數(shù)目的增加而明顯增高。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管基因多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風險相關，但這種影響的效應度往往較低，且受環(huán)境因素的影響（包括內、外環(huán)境）。目前尚無經(jīng)多中心驗證的、較為可靠的與前列腺癌發(fā)病風險及預后相關的遺傳多態(tài)位點。
　　PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路主要參與蛋白質的合成。近年來，國內外陸續(xù)有關該

3、信號轉導通路基因單核苷酸多態(tài)性與前列腺癌易感性關系的研究報道，但結果不盡一致。研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路的活性主要與通路下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1)的生物學活性相關，體內體外研究證實mTORC1的異常與癌癥的發(fā)生相關，并且是雷帕霉素作用的靶點。因此，有理由認為該復合物相關基因的多態(tài)性位點與前列腺癌發(fā)病風險可能相關。mTORC1由一系列直接或間

4、接作用于mTOR的關鍵分子共同組成，這些分子包括Raptor、mLST8、DEPTOR、PRAS40和mTOR。其中，Raptor與mLST8起正向調節(jié)mTOR的作用，而DEPTOR和PRAS40起負向調節(jié)mTOR的作用。本研究將以mTORC1相關基因為候選基因，結合mTOR分子mRNA及蛋白質的表達及下游靶基因p70S6K和4EBP1的表達，在前列腺癌細胞株和前列腺癌組織標本上進行系統(tǒng)性的研究，有助于發(fā)現(xiàn)mTORC1在中國人群中與前列

5、腺癌發(fā)病風險有關的遺傳易感位點，從而為揭示PI3K/AKT/mTOR信號通路相關基因多態(tài)性在前列腺發(fā)病中的作用提供可能的遺傳學證據(jù)，并為前列腺癌術后生化復發(fā)的預測提供可能的新的生物學標記。
　　第一部分 mTORC1相關基因遺傳多態(tài)性與前列腺癌易感性的關聯(lián)性研究
　　為了研究mTORC1相關基因的、具有潛在功能性的SNPs與前列腺癌發(fā)病風險的關聯(lián)性，我們在中國華東地區(qū)漢族人群中選擇1015例前列腺癌病例和1093例健康男性，

6、開展以醫(yī)院為基礎的病例-對照關聯(lián)性研究，并采用Taqman探針方法對SNPs進行基因分型檢測，運用SAS9.1.3軟件包進行統(tǒng)計學描述及關聯(lián)分析。結果發(fā)現(xiàn)，病例組以進展期前列腺癌為主，其中PSA大于20ng/ml的患者占54.4％，小于10ng/ml的患者占17.7％;而Gleason分級≤7(3+4)的患者占31.2％，≥7(3+4)的患者占59.7％;臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者占43.3％，Ⅲ+Ⅳ期患者占49.1％。本研究共檢測了mTOR

7、C1中5個基因的16個SNP位點，結果表明mTOR-rs2536[加性模型:1.34(1.08-1.66)，P=0.008;顯性模型:1.42(1.13-1.78)，P=0.003]，mTOR-rs1034528[加性模型:1.21(1.03-1.42)，P=0.019;顯性模型:1.29(1.07-1.55)，P=0.007]，mTOR-rs2295080[加性模型:0.80(0.69-0.94)，P=0.005;顯性模型:0.76(

8、0.64-0.92)，P=0.003]，及RPTOR-rs1062935[加性模型:1.14(1.01-1.29)，P=0.0341;顯性模型:1.28(1.06-1.56)，P=0.0127]與前列腺癌的發(fā)病風險顯著關聯(lián)。而亞組分析的結果也表明，mTORC1中mTOR-rs536，-134528，-2295080，以及RPTOR-rs1062935與前列腺癌的發(fā)病風險相關，而患前列腺癌的風險也隨著復合物中相關風險基因數(shù)量的增加而明顯提

9、高。本研究中的基因內多位點單倍體分析、基因內多位點聯(lián)合效應分析、以及基因間的聯(lián)合效應分析中都發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)病風險的關聯(lián)性。在logistic顯性模型中我們發(fā)現(xiàn)隨著風險基因型數(shù)目的增加，患前列腺癌的風險也逐漸提高，這種等位基因劑量相關的效應在mTOR多位點的聯(lián)合分析中顯示明顯的前列腺癌發(fā)病關聯(lián)性，在小于69歲，BMI體重指數(shù)小于24kg/m2，曾經(jīng)吸煙，Gleason評分≤7(3+4)，和臨床分期Ⅲ+Ⅳ的人群中尤其明顯。在進一步的交互作

10、用分析中，我們發(fā)現(xiàn)BMI和mTOR-rs2536(P=0.0031),BMI和AKT1S1-rs2290774(P=0.0496)，以及DEPTOR-rs4871827與RPTOR-rs1062935(P=0.0224)之間在前列腺癌發(fā)病方面均存在交互作用。
　　綜上所述，本研究運用較大的樣本量分析了mTORC1中SNPs與前列腺癌發(fā)病風險的關連性，并獲得了有價值的信息。但是本研究還是存在一些局限性。尚需要多中心、更大樣本量及設計

11、更加合理的研究來證實我們的研究結果。
　　第二部分 mTOR基因3，非編碼區(qū)陽性關聯(lián)位點的功能學研究
　　在第一部分的關聯(lián)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點mTOR-rs2536，-rs1034528，-rs2295080，和RPTOR-rs1062935與前列腺癌的發(fā)病風險關聯(lián)。通過在線SNP分析平臺(http://snpinfo.niehs.nih.gov/sn pinfo/snpfu nc.htm)，我們進一步發(fā)現(xiàn)這些位點分別

12、位于相關基因的3'UTR，內含子，基因旁區(qū)和內含子區(qū)。鑒于3'UTR區(qū)是調節(jié)基因活性的關鍵區(qū)域，并和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切關聯(lián)，因此本部分對mTOR-rs2536的生物學意義進行了功能學研究，探尋其可能的生物學調控機制。在本研究中，我們構建并克隆了含有mTOR3'UTR全序列的PGL3-Promoter-mTOR3，UTR質粒，質粒中分別導入mTOR-rs2536野生型及突變型堿基。雙熒光素報告基因法檢測結果顯示，瞬時轉染miRNA-767

13、-3p類似物48小時后rs2536突變型的熒光相對比值要低于野生型，而該miRNA抑制劑的作用剛好相反，提示miRNA-767-3p對野生型堿基的抑制作用較明顯，結果與前期相關性分析結果一致，提示該位點可能通過與相應miRNA結合進而影響mTOR的表達。在隨后的SNPexp在線分析平臺上做出的基因型-免疫表型相關性分析結果提示，mTOR-rs2536位點影響mTOR基因的表達水平，而且這種影響可能具有種族相關性。在本研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)

14、mTOR及其下游基因4EBP1和p70S6K的表達與mTOR-rs2536基因型之間的相關性;但我們發(fā)現(xiàn)，在癌組織中mTOR的表達水平(35.7％)要高于癌旁組織(28.8％);而4EBP1在癌組織及癌旁組織中的高表達率分別為32.1％和13.3％; p70S6K在癌組織及癌旁組織中的高表達率分別達到71.4％和39.4％。提示mTOR、4EBP1及p70S6K的活性與前列腺癌的發(fā)生或發(fā)展相關。
　　綜上所述，mTOR-rs253

15、6可能通過影響mTOR3'UTR與相應miRNA的結合達到調控mTOR的作用。但目前的實驗證據(jù)還是比較輕微，只能作為一種參考，要證實mTOR3'UTR點突變對mTOR本身表達的實際影響，還需要找到本身帶有mTOR該SNP的細胞系進行mRNA和蛋白質水平的研究，才具有確實的說服力。這是本論文的主要不足以及今后研究的方向。
　　第三部分 mTORC1相關基因遺傳多態(tài)位點對前列腺癌臨床結局的風險評估
　　在mTORC1相關基因的遺

16、傳變異因素與前列腺癌預后的相關性研究中，我們選取423例有較完善臨床隨訪資料的前列腺腺泡腺癌患者，結合前期發(fā)病風險關聯(lián)的易感位點mTOR-rs2536、-rs1034528和-rs2295080以及RPTOR-rs1062935不同基因型進行前列腺癌根治術后的生存預后風險評估。結果發(fā)現(xiàn)，在0.1的檢驗標準下，相對于mTOR-rs1062935TT基因型，攜帶CT/CC基因型的患者遠期生化復發(fā)的幾率要高（Plog-rank=0.067）;