豬圓環(huán)病毒2型ORF6基因功能的初步研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染豬可以引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征及豬壞死性和增生性肺炎等多種疾病。PCV2廣泛流行于全世界范圍內，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，然而其致病機制尚不清楚。通過生物信息學分析預測，PCV2含有11個ORFs（ORF1-11）。目前，PCV2被驗證鑒定的蛋白有五個，包括ORF1-5。本研究鑒定了一個新的蛋白，ORF6。ORF6基因全長90bp，位于PCV2的負鏈DNA1611-1522bp，

2、編碼30aa，預測分子量為2.8kD。
　　本研究主要鑒定了PCV2ORF6蛋白，并對其生物學功能進行了初步研究，具體的研究內容有:
　　1.PCV2 ORF6原核表達及多克隆抗體的制備
　　通過設計引物連入一個柔性多肽(Gly4Ser)2，利用PCR，將2個ORF6基因片段串聯(lián)在一起，再插入pGEX-KG原核表達載體中，構建了原核表達質粒pGEX-2ORF6。對其進行原核誘導表達，獲得融合表達蛋白GST-2ORF6，

3、且該蛋白是以可溶形式存在的。進一步純化蛋白，免疫2只兔子，獲得兔高免血清。高免血清濃度分別為1.59mg/mL和2.38mg/mL，效價分別為1∶25×1000和1∶27×1000，抗體1∶1000稀釋可檢測到500pg抗原。
　　2.PCV2ORF6的轉錄表達驗證
　　ORF6基因完全包含于ORF2中，為驗證ORF6 mRNA的轉錄，本研究利用熒光定量PCR檢測了PCV2感染PK-15細胞后的ORF2+6與ORF2的mRN

4、A差異。結果病毒感染細胞后不同時間ORF2+6 mRNA均明顯多于ORF2 mRNA，不同時間ORF2+6約是ORF2的2.1～3倍。驗證了PCV2ORF6 mRNA的轉錄。
　　進一步將PCV2野毒接種PK-15細胞，利用制備的ORF6多抗進行間接免疫熒光檢測，結果觀察到PCV2感染細胞后有特異性綠色熒光，表明PCV2感染細胞內存在ORF6蛋白。驗證了ORF6蛋白的表達。
　　通過ORF6基因的轉錄與蛋白表達檢測，證實了P

5、CV2ORF6編碼蛋白。
　　3.PCV2ORF6的細胞定位及真核表達
　　為研究ORF6蛋白的亞細胞定位，我們將PCV2野毒接種PK-15細胞，利用ORF6多抗進行IFA檢測PCV2ORF6在細胞內的分布情況，結果發(fā)現(xiàn)ORF6主要分布于細胞漿內。
　　本研究構建了ORF6基因的串聯(lián)雙拷貝的真核表達質粒pCAGGS-2ORF6。將表達質粒轉染HEK-293T，通過Western blot檢測驗證了ORF6在體外獲得表達

6、。
　　4.感染性克隆的構建及體外病毒拯救
　　以PCV2全基因組為模板設計引物，擴增含有特定酶切位點HindⅢ、SacⅡ的 PCV2全長基因片段和含2個SacⅡ酶切位點的PCV2全長基因片段，連入pBluescriptSK載體，構建了PCV2雙拷貝感染性克隆（野生型PSK-2PCV2）。同時，為了構建ORF6表達缺失的突變株，通過PCR，將ORF6的起始密碼子ATG進行突變?yōu)锳CG，使其表達沉默，同時不影響ORF2的蛋白編

7、碼序列。再利用與構建野生型PSK-2PCV2同樣方法構建ORF6表達缺失雙拷貝感染性克隆（突變型PSK-2PCV2）。
　　將野生型PSK-2PCV2和突變型PSK-2PCV2感染性克隆轉染PK-15細胞后，盲傳3代。通過熒光定量PCR檢測、ORF2 mRNA轉錄檢測及IFA試驗證實病毒拯救成功，能在體外增殖傳代。
　　利用熒光定量PCR對不同病毒的體外增殖情況進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒仍能進行復制，迸一步利用一步

8、法增殖曲線發(fā)現(xiàn)ORF6缺失后病毒的增殖滴度明顯下降。證實ORF6不是病毒復制所必需的基因，但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。
　　5.PCV2 ORF6的生物學功能
　　本研究利用凋亡檢測試劑盒對單獨表達ORF6及野生型和突變型病毒感染細胞后的caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性進行檢測，結果顯示，單獨表達PCV2ORF6不能激活caspase-3、caspase-8、caspase-9。但突變

9、毒株較野生毒株的caspase-3蛋白活性顯著升高，caspase-8蛋白活性有所下降，caspase-9的蛋白活性無顯著差異。ORF6在PCV2誘導凋亡中的作用還需進一步研究。
　　將ORF6真核表達質粒轉染PK-15細胞，利用熒光定量PCR檢測IFN-β、TNF-α、RANTES、 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13等細胞因子的表達量，結果發(fā)現(xiàn)單獨表達ORF6能促使IFN-β、T

10、NF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細胞因子表達量顯著升高。同時將野生重組型(w-2PCV2)、突變型(m-2PCV2)病毒分別接種PK-15細胞，熒光定量PCR檢測上述細胞因子表達量，發(fā)現(xiàn)ORF6缺失導致病毒感染細胞后IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13等細胞因子表達量顯著下降。綜合ORF6表達與病毒感染分析，證實ORF6蛋白能激活IFN-β、 TN

11、F-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細胞因子的表達。
　　6.PCV2 ORF6對IL-10的影響
　　IL-10參與病毒感染宿主誘導的免疫調節(jié)及免疫抑制反應，為探究ORF6引起IL-10表達量上升的信號通路，利用不同的信號通路抑制劑對其進行研究，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶PKC抑制劑GF-109203X能顯著下調ORF6激活IL-10的表達量。進一步利用不同濃度的GF-109203X抑制劑處理細胞，發(fā)現(xiàn)ORF6誘

12、導IL-10的表達量與抑制劑濃度呈反比關系，即抑制劑濃度越高，其ORF6誘導IL-10的表達量越低。表明ORF6誘導IL-10表達是通過蛋白激酶C通路激活的。
　　總之，本研究新鑒定了PCV2ORF6蛋白，其表達定位于細胞漿內。ORF6不是病毒復制所必需的基因，但ORF6影響病毒在體外的增殖滴度。ORF6蛋白能激活IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13細胞因子的表達，且通過蛋白激酶C通路激活I