核轉(zhuǎn)錄因子Snail調(diào)控二氧化硅誘導的人支氣管上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型作用機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究核轉(zhuǎn)錄因子Snail在二氧化硅(SiO2)誘導的人支氣管上皮細胞(HBE)上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)中的作用機制。
   方法:以200μ g/mlSiO2刺激的HBE細胞為模型,⑴不同時間點(0、1、6、12、18、24h)用倒置顯微鏡觀察HBE細胞形態(tài)學改變;⑵不同時間點(0、24h)用電子顯微鏡觀察HBE細胞超微結(jié)構(gòu)改變;⑶不同時間點(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot檢測HBE細胞Snai

2、l總蛋白表達水平的變化;⑷不同時間點(0、1、6、12、18、24h)用Western-Blot檢測HBE細胞Snail核蛋白表達水平的變化;⑸不同時間點(0、1、6、12、18、24h)用免疫細胞熒光檢測HBE細胞Snail的核定位情況;⑹不同時間點(0、12、18h)用EMSA檢測HBE細胞Snail DNA結(jié)合活性的變化情況;(7)RNA干擾Snail的表達后,Western-Blot檢測HBE細胞Snail、α-SMA、Vime

3、ntin、E-cad蛋白表達水平的變化。
   結(jié)果:⑴倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示:HBE細胞與SiO2共育后,隨著時間的延長,原呈鋪路石樣排列的HBE細胞出現(xiàn)梭形、紡錘形改變,間隙略微增寬。⑵電鏡結(jié)果顯示:對照組的細胞大多為圓形,表面微絨毛豐富;SiO2誘導HBE細胞24h時梭形多見,細胞核多形性,細胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)減少甚至缺失,代之表現(xiàn)為突起,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量管狀結(jié)構(gòu),次級溶酶體內(nèi)可見細胞吞噬的SiO2顆粒。⑶Western-bl

4、ot檢測總蛋白的結(jié)果顯示:在SiO2作用下,Snail表達隨著時間的延長逐漸上調(diào),18h表達達到頂峰,之后逐漸下降;12h組和18h組Snail蛋白的表達水平分別為(2.88±0.63)和(4.51±1.15),與對照組的(0.57±0.04)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P(0.05)。⑷Western-blot檢測核蛋白的結(jié)果顯示:在SiO2作用下,Snail表達隨著時間的延長逐漸上調(diào),12h表達達到頂峰,之后逐漸下降;12h組和18h

5、組Snail蛋白的表達水平分別為(4.51±0.81)和(2.76±0.77),與對照組的(0.67±0.15)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑸免疫細胞熒光結(jié)果顯示:對照組可見到微弱熒光表達于胞漿,核內(nèi)未見表達;實驗組熒光主要表達于細胞核,隨著SiO2作用時間的延長,Snail表達逐漸向核內(nèi)移位。⑺EMSA結(jié)果顯示:在SiO2作用下,12h組和18h組Snail DNA結(jié)合活性的表達水平分別為(0.020±0.00047)和

6、(0.023±0.0011),與對照組的(0.0014±0.00026)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明SnailDNA結(jié)合活性明顯升高。⑺siRNA結(jié)果顯示:①刺激組和干擾組Snail蛋白的表達水平分別為(20.02±1.44)和(6.73±1.03),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明siRNA干擾后Snail表達下調(diào),抑制率為66.38%;②刺激組和干擾組E-cad蛋白的表達水平分別為(0.18±0.03)和(0

7、.84±0.01),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明siRNA干擾后E-cad表達上調(diào):③刺激組和干擾組α-SMA和vimentin蛋白的表達水平分別為(2.35±0.45)和(0.23±0.05),(13.12±1.09)和(2.33±0.54),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明siRNA干擾后α-SMA和vimentin表達下調(diào),抑制率分別為90.21%和82.24%。
   結(jié)論:①SiO2可誘導人支氣管上皮

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