IL-1β和PGE-,2-在煙霧吸入性損傷修復中作用的實驗研究.pdf

1、研究背景與總體思路：
　　 吸入性損傷是燒傷病人常見的合并損傷,其中煙霧是最常見的致傷因素。當吸入性損傷出現(xiàn)后機體將立即啟動損傷修復過程以保證肺的正常功能,損傷后可能會完全修復,也可能會導致氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄,從而引起患者呼吸困難,生活質量嚴重下降。怎樣盡早促進吸入性損傷修復和預防損傷修復后氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄?是一個臨床上非常棘手的問題,目前研究熱點主要集中在細胞周期調控、細胞外基質及細胞因子在氣道粘膜損

2、傷修復過程中的作用。氣道損傷修復是一個非常復雜的過程,多種細胞類型主要為氣道上皮細胞和成纖維細胞、多種炎癥介質和細胞外基質成分共同參與,這個過程中可出現(xiàn)纖維化、瘢痕形成,導致氣道狹窄。目前研究表明在氣道損傷修復過程中,炎癥反應是一個必不可少的部分,它可以促進損傷盡早修復,但是過度炎癥反應與損傷修復的后果,尤其是與纖維化瘢痕形成密切相關;另一方面,在胎兒的損傷修復中研究發(fā)現(xiàn)減少對損傷的炎癥反應與缺乏瘢痕形成和纖維化的再生修復過程相關。以往

3、研究還表明成纖維細胞是細胞外基質的主要來源,它的募集、聚集與激活影響損傷后組織的正常愈合和纖維化形成的過程,在損傷部位,炎癥與成纖維細胞活性的關系可能對損傷修復的最終后果和瘢痕形成程度起重要作用,因此,研究炎癥因子與氣道成纖維細胞在氣道粘膜損傷修復中的作用,對促進氣道損傷早日修復及防止損傷修復后氣道狹窄具有重要意義。
　　 白介素-1β(IL-1β),是一種多功能的生物活性物質,被認為是早期炎癥反應中重要的炎癥介質,可由各種細胞

4、包括上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞分泌的一種細胞因子。在損傷部位IL-1β分泌可刺激IL-6、IL-8、PGE2分泌,這些炎癥介質是使損傷部位活動協(xié)調的整合炎癥反應中的一個部分。前列腺素E2(PGE2)是一個輔助性炎癥介質,通過環(huán)氧合酶合成、由PGE2合酶激活、被多種酶包括脫氫酶降解。在組織修復中,PGE2是參與調節(jié)炎癥與纖維化的重要炎癥介質,它通過調節(jié)成纖維細胞遷移率來抑制成纖維細胞趨化性,通過阻斷成纖維細胞增殖和膠原產(chǎn)生來影響成纖維

5、細胞在損傷修復中基質收縮與重構中的作用。PGE2在損傷修復過程中早、晚期階段表達,它能抑制纖維化反應,包括膠原產(chǎn)生、細胞外基質收縮及成纖維細胞增殖,還能刺激上皮細胞遷移,參與損傷修復這一階段。為此我們設想,IL-1β和PGE2在氣道粘膜損傷修復過程中可能起重要作用,可能為臨床上判斷氣道粘膜損傷修復過程不同階段提供新的手段;對促進氣道粘膜損傷盡早修復和預防損傷修復后氣道纖維化、瘢痕形成致氣道狹窄提供一定的理論依據(jù)。
　　 本研究的

6、總體思路為:
　　 首先,建立煙霧吸入性損傷修復動物(新西蘭白兔)模型,通過檢測氣道分泌物IL-1β、PGE2和病理改變以及IL-1βmRNA、COX-2mRNA表達,旨在明確
　　 ①損傷修復過程中不同階段(損傷期和修復期);
　　 ②IL-1β、PGE2在煙霧吸入氣道粘膜損傷修復過程中不同時間點水平變化與病理改變的關系,可能為臨床上判斷氣道粘膜損傷修復過程不同階段提供檢測手段;
　　 ③IL-1βmR

7、NA、COX-2mRNA表達變化與病理改變之間的關系。
　　 然后,根據(jù)上部分的研究結果,以原代氣道成纖維細胞為研究對象,觀察IL-1β和PGE2之間的相互關系,利用ELISA法測定PGE2水平和Western印跡法檢測各項指標COX-2、mPGES1、EP2與15-PGDH表達。從細胞和分子生物學水平,研究IL-1β對氣道成纖維細胞PGE2表達的影響,進一步探討IL-1β、PGE2在吸入性損傷修復中的作用。
　　 第一

8、部分(體內(nèi)實驗)、煙霧吸入性損傷修復模型IL-1β和PGE2表達的變化
　　 目的:探討IL-1β和PGE2在新西蘭白兔煙霧吸入性損傷氣道修復中表達變化,及其與病理改變的關系。
　　 方法：新西蘭白兔36只,隨機分為正常對照組、煙霧吸入性損傷后第1、4、7、14和21d組,共6組,各組依次收集氣道分泌物和常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色做病理切片,應用ELISA和RT-PCR方法檢測各組IL-1β、PGE2及COX-2表達。建

9、立煙霧吸入性損傷修復模型,光鏡下觀察煙霧吸入對實驗兔氣管、肺組織的病理變化。
　　 結果：
　　 ①病理變化表明煙霧吸入性損傷第1、4、7d組以損傷后炎癥反應為主(損傷期),第14、21d組以損傷后修復為主(修復期),這表明煙霧吸入性損傷修復模型成功建立;
　　 ②ELISA結果表明:IL-1β含量在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,至第21d最低,損傷期第7d組(253.3±96.2)與修復期第14d組(96.2

10、±67.8)比較有顯著差異(P＜0.01);PGE2含量在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,至第21d達到頂峰,修復期第14d組(85521±24015)與損傷期第7d組(32486±19811)比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　 ③RT-PCR結果表明:IL-1βmRNA表達在煙霧吸入性損傷后第1d立即升高,損傷期第1、4d組IL-1βmRNA表達明顯高于修復期第14、21d組,第4d組(1.75±0.31)與第14d組(0

11、.75±0.33)比較有顯著性差異(P＜0.01);COX-2mRNA表達在煙霧吸入性損傷后第1d升高,在第21d達到最高,修復期第14、21d組(COX-2mRNA表達明顯高于損傷期第1、4d組,第14d組(1.86±0.31)與第1d組(1.03±0.26)比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 結論：通過建立煙霧吸入性損傷修復模型,觀察IL-1β和PGE2的動念變化,發(fā)現(xiàn)IL-1β在損傷期水平明顯上調,而PGE2在修復期

12、水平更高,這說明IL-1β與PGE2可能與煙霧吸入性損傷修復過程中病理變化具有相關性,可能為臨床上判斷煙霧吸入性損傷修復過程不同階段(損傷期、修復期)提供幫助。
　　 第二部分(體外實驗)、IL-1β對氣道成纖維細胞PGE2表達的影響
　　 目的:研究IL-1β對小鼠氣道成纖維細胞PGE2表達的影響,以探討其在吸入性損傷修復中的作用。
　　 方法：分離雄性昆明種小鼠的氣道成纖維細胞細胞并體外培養(yǎng),分別收集IL-1

13、β作用后不同時間點和不同濃度的IL-1β作用后的培養(yǎng)上清液及細胞:采用ELISA法和western blot技術測定PGE2水平,COX-2、mPGES1、EP2與15-PGDH蛋白表達。
　　 結果：
　　 ①經(jīng)IL-1β1ng/ml處理后不同時間點氣道成纖維細胞培養(yǎng)上清液PGE2水平在8h(148.2±28.3pg/ml)、16h(267.6±45.4pg/ml)、24h(210.5±38.6pg/ml)、48h(1

14、98.7±36.5pg/ml)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h水平最高;氣道成纖維細胞COX-2表達在8h(0.478±0.029)、16h(0.672±0.047)、24h(0.617±0.036)、48h(0.593±0.034)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h表達水平最高:氣道成纖維細胞mPGES1的表達在8h(0.300±0.018)、16h(0.549±0.034)、24h(0.497±O.030)

15、、48h(0.443±0.026)均顯著高于各對照組(P＜0.01),其中16h表達水平最高;氣道成纖維細胞EP2、15-PGDH的表達在8h、16h、24h、48h與各對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ②不同濃度IL-1β處理氣道成纖維細胞后,氣道成纖維細胞培養(yǎng)上清液PGE2水平在IL-1β0.1ng/ml組(142.9±22.3pg/ml)、1ng/ml組(267.6±45.4pg/ml)和10ng/ml組(

16、587.3±106.9pg/ml)均顯著高于對照組(58.5±16.0pg/ml)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01);氣道成纖維細胞COX-2表達在IL-1β0.1ng/ml組(0.525±0.031)、1ng/ml組(0.672±0.047)和10ng/ml組(1.012±0.064)均顯著高于對照組(0.309±+0.019)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01);氣道成纖

17、維細胞mPGES1表達在IL-1β0.1ng/ml組(0.380±0.021)、1ng/ml組(0.549±0.034)和10ng/ml組(0.879±0.045)均顯著高于對照組(0.199±0.012)(P＜0.01),并且這三組之間比較差異也有顯著性(P＜0.01):氣道成纖維細胞EP2、15-PGDH的表達在IL-1β0.1ng/ml組、1ng/ml組和10ng/ml組與對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)。