牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的原核表達與巢式RT-PCR檢測方法的建立和應用.pdf

1、牛病毒性腹瀉(Bovineviraldiarrhea，BVD)是牛的主要疾病之一，可引起牛的生產(chǎn)性能下降而給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。牛病毒性腹瀉病毒基因組編碼11種蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保護性抗原，能誘導中和抗體的產(chǎn)生，保護動物不受同源毒株的攻擊。本試驗用經(jīng)序列測定已知的牛病毒性腹瀉病毒BA毒株，接種MDBK細胞，提取病毒基因組RNA。根據(jù)BA毒株基因組序列，利用Oligo6生物學軟件設計可以擴增E2蛋白的一對引物，引入酶切位點

2、并去掉E2蛋白的跨膜區(qū)及疏水區(qū)。通過RT-PCR擴增了長約1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T載體上，酶切并測序鑒定。然后將目的片段進一步定向克隆到pET30a表達載體，轉化BL21表達菌。取轉化菌培養(yǎng)，并用IPTG誘導，獲得了以包涵體形式表達的重組蛋白。將重組蛋白經(jīng)變性、純化、復性后，用Westernblotting、間接ELISA檢測表明純化的重組蛋白具有良好的免疫原性，為牛病毒性腹瀉病毒診斷試劑的研制奠定了基礎。

3、 同時利用GenBank中已發(fā)表的BVDV基因組序列中5'端保守序列設計巢式引物。應用Oligo6軟件設計了2對引物，一對為外部引物，預期擴增片段大小為294bp；一對為內(nèi)部引物，預期擴增片段大小為1.54bp。經(jīng)過Blast對比分析，這一對引物可以檢測所有類型的BVDV、豬瘟病毒和邊界病病毒。應用這兩對引物，建立了BVDV的巢式RT-PCR檢測方法。應用該方法檢測了現(xiàn)地采集的牛血清、商品化的細胞培養(yǎng)用新生牛血清和成年牛血清、流產(chǎn)牛胎

4、兒組織等樣品，結合核苷酸序列分析表明該方法可以特異地檢測BVDV和豬瘟病毒的RNA，該法靈敏、準確、快速，可用于BVDV等瘟病毒RNA的快速檢測。通過對擴增片段的核苷酸序列分析與系統(tǒng)進化樹分析，初步確定國內(nèi)流行的BVDV主要為Ⅰ型，可分為4個不同的亞型，為國內(nèi)BVDV的防治提供了技術支持。 本試驗建立了BVDVRT-PCR診斷方法，并證明該方法不僅可以準確快速診斷BVDV，而且可以診斷BVDV同屬的豬瘟病毒。同時利用pET30a