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文檔簡介
1、牛病毒性腹瀉(Bovineviraldiarrhea,BVD)是牛的主要疾病之一,可引起牛的生產(chǎn)性能下降而給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。牛病毒性腹瀉病毒基因組編碼11種蛋白,其中E2蛋白是病毒主要的保護性抗原,能誘導中和抗體的產(chǎn)生,保護動物不受同源毒株的攻擊。本試驗用經(jīng)序列測定已知的牛病毒性腹瀉病毒BA毒株,接種MDBK細胞,提取病毒基因組RNA。根據(jù)BA毒株基因組序列,利用Oligo6生物學軟件設計可以擴增E2蛋白的一對引物,引入酶切位點
2、并去掉E2蛋白的跨膜區(qū)及疏水區(qū)。通過RT-PCR擴增了長約1000bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T載體上,酶切并測序鑒定。然后將目的片段進一步定向克隆到pET30a表達載體,轉化BL21表達菌。取轉化菌培養(yǎng),并用IPTG誘導,獲得了以包涵體形式表達的重組蛋白。將重組蛋白經(jīng)變性、純化、復性后,用Westernblotting、間接ELISA檢測表明純化的重組蛋白具有良好的免疫原性,為牛病毒性腹瀉病毒診斷試劑的研制奠定了基礎。
3、 同時利用GenBank中已發(fā)表的BVDV基因組序列中5'端保守序列設計巢式引物。應用Oligo6軟件設計了2對引物,一對為外部引物,預期擴增片段大小為294bp;一對為內(nèi)部引物,預期擴增片段大小為1.54bp。經(jīng)過Blast對比分析,這一對引物可以檢測所有類型的BVDV、豬瘟病毒和邊界病病毒。應用這兩對引物,建立了BVDV的巢式RT-PCR檢測方法。應用該方法檢測了現(xiàn)地采集的牛血清、商品化的細胞培養(yǎng)用新生牛血清和成年牛血清、流產(chǎn)牛胎
4、兒組織等樣品,結合核苷酸序列分析表明該方法可以特異地檢測BVDV和豬瘟病毒的RNA,該法靈敏、準確、快速,可用于BVDV等瘟病毒RNA的快速檢測。通過對擴增片段的核苷酸序列分析與系統(tǒng)進化樹分析,初步確定國內(nèi)流行的BVDV主要為Ⅰ型,可分為4個不同的亞型,為國內(nèi)BVDV的防治提供了技術支持。 本試驗建立了BVDVRT-PCR診斷方法,并證明該方法不僅可以準確快速診斷BVDV,而且可以診斷BVDV同屬的豬瘟病毒。同時利用pET30a
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