煙草CN基因調控植株抗TMV機理研究.pdf

1、煙草普通花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是Togaviridae科Tobamo-virus組的單鏈RNA(signal strand RNA,ssRNA)病毒,可侵染包括茄科植物在內的350多種植物。煙草是茄科植物中具有特殊地位的經(jīng)濟作物,敏感煙草感染TMV后可引起30-50％損失,嚴重的甚至絕收。據(jù)統(tǒng)計,全世界每年僅因MV危害造成的損失就高達1億美元,而TMV在我國吉林、河南、山東、貴州、云南等省的煙草種植

2、區(qū)均有發(fā)生,田間發(fā)病率一般在5-20%。貴州作為全國的第二大烤煙種植大省,廣泛種植有南江3號、貴煙4號、云煙87、K326、云煙97等重要的烤煙品種。其中,僅K326品種在2012年的種植面積就近1.22萬公頃,占貴州烤煙總種植面積的33.8%,但該品種易感TMV,可造成極大的損失,據(jù)統(tǒng)計貴州每年因TMV造成的損失就高達0.32億元。利用TMV抗性基因(resistance gene)進行抗性育種是最為經(jīng)濟、安全、長效的方法之一。本研究

3、以黃花煙(N.rustica L.)來源的抗性CN作為抗源,構建了3個含CN基因的植物表達載體pSH-CN,pGM626-DL-SAF-UCn和pSH737-U4Cn-RcHak并分別對K326進行遺傳轉化,對篩選獲得的轉基因植株進行人工接種TMV,分析轉基因植株應答TMV侵染后的表現(xiàn)和探討CN基因介導的抗病機理。主要獲得如下結果:
　　1.轉CN基因煙草接種TMV后引起了接種葉片產(chǎn)生超敏反應(hypersensitive,HR)

4、,降低了脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,延緩了由于TMV繁殖擴散所引起的花葉斑形成和葉綠素含量下降,表明CN基因的導入可誘導機體產(chǎn)生HR,在接種葉片形成壞死斑(necrosis spots),從而限制病毒的擴散,延緩病毒引起的植株系統(tǒng)感染;同時,轉基因植株應答TMV感染時,可顯著降低MDA含量,更好地保護植物細胞免遭質膜過氧化產(chǎn)物的損害,提高植株細胞對病原菌的防御能力;另外,CN基因的導入引起了植株

5、產(chǎn)生了系統(tǒng)超敏反應(systemic hypersensitive, SHR), SHR的發(fā)生亦可提高植株對其它入侵病原菌的系統(tǒng)抗性;
　　2.接種TMV后,轉基因植株中的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs),包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),過氧化物酶(peroxidase,POD)和過氧化酶(catalase)的酶活性均顯著增加,說明轉基因植株在防衛(wèi)TMV侵染時可通

6、過顯著提高AOEs活性來實現(xiàn)自身對入侵病毒的抵抗力。AOEs活性高低一般認為與機體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量正相關,植物體受到生物或非生物脅迫時通?？梢鹌潴w內ROS的迅速增加,而高ROS含量會嚴重導致細胞受損。因此,轉基因植株接種TMV后一方面通過提高AOEs活性使植物細胞免遭ROS的氧化損傷,保護其完整性,提高植物組織對病原菌的防衛(wèi)能力,一方面高的AOEs活性對于調節(jié)以抗性基因介導的抗病

7、應答通路啟動也十分重要;
　　3.轉基因植株在接種 TMV后引起了植物體內過氧化氫(hydrogen peroxide)和水楊酸(salicylic acid,SA)含量的顯著增加,兩者在抗性基因(resistance gene,R)介導的抗病應答信號通路中作為信號分子調控或激活下游抗病基因的表達。H2O2的積累與AOEs活性增加有關,病原菌的侵入后導致植物體 O·2-迅速增加,SOD可催化O·2-形成H2O2,進而減小由于O·2

8、-的過剩積累所引起的組織氧化損傷;H2O2可作為POD和CAT的底物被進一步代謝,前者主要利用H2O2氧化多種底物,如酚類,乙醇和甲醛等,起到毒害物質(H2O2)脫毒的作用;后者可直接將催化H2O2形成H2O。TMV接種初期, CN基因顯著提高了轉基因植株中AOEs的活性;接種后期,轉CN基因植株又顯著降低了CAT酶活性, CAT酶活性的降低引起了H2O2含量增,后者在植物產(chǎn)生HR和系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired re

9、sistance,SAR)中起到重要作用。TMV接種引起轉基因植株SA含量的顯著增加,而SA又可作為內源信號分子調控植株的抗病應答機制啟動,已有研究表明SA可結合于病程相關蛋白基因PR-1a啟動子序列的類as-1調控區(qū),從而啟動該基因表達提高植株對病原菌的防御能力;
　　4. TMV接種后,CN基因誘導了抗病應答信號通路中蛋白組分,如CN(N-like protein)、RAR1(required for MLa12 resist

10、ance)、STG1(suppressor of G2 alleleof skp1)、MEK1(mitogen-activated protein kinase kinase)、NTF6(mitogen-activated protein kinase)、PR-1a(pathogenesis-related proteins1a),和轉錄因子WRKY1表達量的顯著上調。一般認為,病原菌入侵后其無毒基因(avirulence,Avr)編碼

11、產(chǎn)物可與植物體內 R基因編碼的產(chǎn)物以―R-Avr的方式形成復合物,進而調控下游抗病相關基因的表達的轉錄激活。轉基因植株接種 TMV后,引起了CN基因表達量的顯著上調,說明TMV入侵誘導TMV-Avr-CN復合蛋白的形成,之后蛋白組分RAR1和STG1的表達量也顯著增加,表明Avr-CN復合蛋白可進一步與STG1和RAR1結合形成原初―病原菌-宿主復合蛋白調控下游抗病基因的表達。在STG1和RAR1表達量上調之后,其他蛋白組分NTF6、M

12、EK1和轉錄因子的表達量也隨之增加,說明該復合蛋白在激酶磷酸化作用經(jīng)由促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)途徑信號通路(mitogen-activated protein kinase cascades,MAPK cascades)調控下游PRs的表達,從而實現(xiàn)轉基因植株對TMV的控制;
　　5.本研究通過植物表達載體 pGM626-DL-SAF-UCn對煙草進行遺傳轉化,分析外源基因,包括篩選報告基因Bar:GUS、重組酶(recombin

13、ase)基因FLP和抗病基因CN在轉基因煙草植株中的清除情況。隨著轉基因煙草葉片逐漸衰老成熟,煙葉對除草劑草銨膦(phosphinothricin,PPT)敏感性逐漸增加,對GUS(β-glucuro-nidase)染色活性逐漸下降,說明轉基因煙草植株中―Gene-deletor system實現(xiàn)了包括Bar:GUS, FLP和CN在內的所有外源基因的清除。―Gene-deletor技術的應用為創(chuàng)制培育無選擇標記、抗病煙草新種質提供理論

14、基礎;
　　6.利用pSH737-U4Cn-RcHak對煙草K326進行遺傳轉化不僅通過CN基因介導的抗病應答機制提高轉基因煙草植株對TMV的抗性,而且煙草高親和鉀離子轉運蛋白(high-affinity potassium transport,HAK)的共同導入增加了轉基因植株的葉片厚度,減小了接種葉抗病斑的大小。說明CN和HAK的協(xié)同表達不僅提高了轉基因植株對 TMV的內部防御(CN介導的抗病調控),同時也增強植株對TMV的體