副結核分枝桿菌hsp65基因的克隆、表達與免疫研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、副結核病(Paratuberculosis)是由副結核分枝桿菌即禽分枝桿菌副結核亞種(Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis,MAP)引起的一種以反芻動物為主要宿主的慢性增生性、頑固性腸炎和進行性消瘦為特征的傳染病,也稱Johne’s病。該病不僅使病畜的飼料報酬降低,產奶量和繁殖力下降,造成巨大的經濟損失,而且還與人類的克隆氏(Crohn's)病存在潛在聯系,因此,愈來愈受到世界各國的廣泛

2、關注。目前,該病尚無經濟有效的治療藥物,控制該病的主要措施是加強飼養(yǎng)管理和消除傳染源,即以變態(tài)反應、ELISA、病原分離鑒定等方法進行檢疫,對檢出的陽性牛隔離與淘汰。此外,也可采用預防接種的方法來控制該病,即將MAP滅活或致弱后制成疫苗進行免疫,接種疫苗不僅使該病的臨床型病例減少90%,而且減少了亞臨床感染動物的數量和組織學或細菌學檢測陽性的病例。但是,菌苗接種后會干擾該病和結核病的變態(tài)反應和血清學檢測,許多國家已經禁止使用接種菌苗來控

3、制副結核病。因此,研究開發(fā)副結核病的新型疫苗勢在必行。 熱休克蛋白(HSPs)是生物體受到物理、化學、生物、精神等刺激時發(fā)生應激反應而合成的高度保守的蛋白質。根據分子量,將主要的熱休克蛋白分為5個家族:大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。Hsp60作為一種分子伴侶,能協助變性、不可溶的凝聚蛋白重新恢復天然構象,在許多病原體傳染過程中是免疫優(yōu)勢抗原。hsp65基因又名groEL2基因,其編碼

4、的蛋白是HSP60家族成員,不僅可作為分枝桿菌的主要保護性抗原,還具有幫助樹突狀細胞遞呈抗原等功能。Hsp10(GroES)作為輔分子伴侶,在GroLS指導蛋白質折疊過程中具有輔助其活性的作用,同時作為一種有效的T細胞抗原,能刺激機體產生特異性細胞免疫應答,使外周血單核細胞出現增殖反應并產生IFN-γ,是制備新型疫苗的候選抗原。 為了研發(fā)預防副結核病的新型疫苗尤其是DNA疫苗及相關蛋白功能,本研究選擇了MAP的主要保護性抗原Hs

5、p65蛋白,以副結核分枝桿菌C-2株染色體DNA為模板,以hsp65基因的特異性引物進行PCR擴增,獲得了1626bp的hsp65基因,通過T-A克隆技術,將PCR產物克隆至pGEM-T Vector中,以質粒大小、酶切分析、PCR擴增及序列分析鑒定重組克隆,成功地構建出克隆質粒pGEM-T-hsp65,以DNASTAR軟件分析了所克隆基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列,結果表明,所獲得的hsp65基因與GenBank中MAPK-10株

6、該基因核苷酸大小完全一致,兩者核苷酸序列的同源性為99.1%,氨基酸序列的同源性為99.3%,表明該基因在副結核分枝桿菌中高度保守。進一步將pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pET-32a(+)原核表達系統中,構建了高效原核表達質粒pET-32a-hsp65,在與之相匹配的E.coli BL21(DE3)表達菌株中,該質粒經IPTG誘導獲得了76Ku的融合蛋白。經免疫印跡分析證實,該融合蛋白具有與副結核分枝桿

7、菌多克隆抗體發(fā)生反應的特性。 在上述研究的基礎上,為研究開發(fā)MAP主要保護性基因hsp65的DNA疫苗,將克隆質粒p GEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至真核表達載體pVAX1中,成功構建了真核表達重組質粒pVAX1-hsp65,并以陽離子聚合物基因轉染試劑將真核表達重組質粒轉染至BHK-21細胞中,通過熒光抗體和RT-PCR技術證實hsp65基因可以在哺乳動物細胞中表達,同時將pGEM-T-hsp65中

8、的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pVAX1-hsp10中,成功構建了真核表達重組質粒pVAX1-hsp65-10。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10重組質粒免疫BALB/c小鼠,同時設pVAX1、生理鹽水為對照組。特異性抗體檢測結果顯示,免疫小鼠體內分別產生了針對Hsp65的特異性抗體,且二價基因免疫組的抗體水平高于單價基因。淋巴細胞轉化試驗結果顯示,pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10

9、免疫組的淋巴細胞增殖活性高于生理鹽水對照組,而pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10實驗組之間差異不顯著(P>0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T細胞檢測結果顯示,pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫組CD8+T細胞水平高于對照組,尚未達到統計學的顯著水平(P>0.05),但也表明實驗組產生了較高的以MHCⅠ類分子遞呈的細胞免疫應答,pVAX1-hsp65免疫組的CD4+、CD3+T細胞數量明顯高

10、于其它組。重組質粒pVAX1-hsp65-10免疫組小鼠的IFN-γ水平明顯高于對照組,pVAX1-hsp65免疫組的小鼠IFN-γ水平略高于對照組,均未達到統計學上的顯著水平(P>0.05),但結果顯示,重組質粒pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10均使免疫小鼠產生了細胞免疫,而且二價基因的免疫效果優(yōu)于單價基因。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫豚鼠,同時設pVAX1和副結核分枝桿菌超聲

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