利用噬菌體展示技術鑒定vvIBDV抗原表位及多表位模擬蛋白表達.pdf

1、抗原表位，又稱抗原決定簇，是抗原分子抗原性的基礎?？乖砦皇堑鞍踪|抗原性的物質基礎。用于正確而詳細地繪制抗原表位圖譜對疾病地診斷、設計無毒副作用地多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義。因此目前在預防醫(yī)學領域許多關于以表位為基礎的，如表位疫苗和特異性診斷試劑等的研究也就成了熱點。而噬菌體展示技術作為近年來新興起的研究蛋白質抗原表位的有利工具，已經成功地鑒定出了多種病原微生物地抗原表位。這就為揭示一些病原體未知地抗原表位，從而進一步達

2、到預防和控制疾病地發(fā)生提供了條件。 傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起的一種急性接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害雛雞的中樞免疫器官--法氏囊，導致免疫抑制。且對其他疫病的易感性增強，飼養(yǎng)成本增加的同時導致藥物殘留，危害人類健康，造成經濟損失。近年來，IBDV分子生物

3、學研究雖然己取得了較大進展，但在分子水平對雞傳染性法氏囊病病毒的免疫機理、致病機制、病毒分子結構與功能方面仍然有許多問題有待于進一步深入研究，而鑒定IBDV抗原表位有助于揭示病毒與機體相互作用的本質，從而了解IBDV的致病機制和免疫機理。本研究共分兩個部分： 一、四株IBDV-VP2單抗的抗原表位的鑒定和序列分析為研究IBDV的免疫機理和致病機理，利用4株IBDVVP2單克隆抗體1B5、5D1、2H11和I-4-4-3作為篩選分

4、子，對噬菌體展示12肽庫進行3輪“吸附一洗脫一擴增”淘洗，從每株單克隆抗體篩選到的噬菌斑中隨機挑取15個單克隆藍色噬菌斑，合計60個，通過間接ELISA檢測，A40s值均大于1.00，且均大于陰性對照A405值的2倍；競爭抑制ELISA分析，單克隆抗體和IBDV抗原均能競爭抑制篩選12肽與固相包被單克隆抗體的反應，抑制率大于40％，表明在該12肽內含有IBDV抗原表位。選取20個單克隆噬菌斑(5個單克隆噬菌斑×4株單克隆抗體)，經噬菌體

5、pⅢ部分基因的核苷酸序列測定，確定了4個優(yōu)勢12肽為不同IBDV抗原表位，這4個12肽在一級結構上沒有3個以上連續(xù)氨基酸與GenBank中IBDVVP2的氨基酸序列相同之處，推測可能是構象依賴性表位。 二、IBDV多表位模擬肽串聯(lián)基因的表達與免疫原性分析為研制抗原表位疫苗奠定基礎，本研究利用4株傳染性法氏囊病病毒(IBDVVP2)單克隆抗體(mAb)從噬菌體隨機肽庫中得到了4個含有不同IBDVVP2抗原表位的模擬肽序列。在此基礎

6、上，將4個抗原表位用GGGS四肽連接構建多表位基因4epis。將該基因合成、克隆后，構建原核表達質粒pET-4epis，在大腸桿菌中表達重組多表位蛋白r4EPIS，經掃描SDS-PAGE圖分析，r4EPIS菌體占總蛋白的20％、分子量30kDa。用IBDV的單克隆抗體和多克隆抗體對r4EPIS進行免疫印跡對比分析，結果表明，r4EPIS具有IBDV特異性和免疫反應性。將r4EPIS經皮下注射免疫兔，第一次免疫7d后抗體效價為1:212，