尼古丁影響人牙周膜細胞IL-1β、IL-6表達及誘導(dǎo)Th17分化的體外研究.pdf

1、牙周炎是一種危害人體口腔健康的常見和高發(fā)病，可造成牙周支持組織的進行性破壞。吸煙作為牙周炎的高危因素，與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其機制尚不明確。尼古丁作為煙草中的主要毒性物質(zhì)，在吸煙相關(guān)性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)大鼠的牙周組織和體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞中存在尼古丁的特異性受體—煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)

2、的表達，尼古丁可明顯上調(diào)該受體的表達，加重牙周組織炎癥。提示尼古丁可能通過與α7nAChR結(jié)合后產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，進而影響疾病的進程，但其機制尚不完全明了。
　　目前研究認為免疫反應(yīng)最終決定了牙周炎的發(fā)展方向。最近發(fā)現(xiàn)的一種可以特異性分泌IL-17的Th17細胞，憑借強大的促炎和骨破壞作用影響牙周炎的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。而尼古丁與α7nAChR特異性結(jié)合后，是否能通過誘導(dǎo)Th17細胞分化生成，引起免疫炎癥反應(yīng)進而影響吸煙相關(guān)性牙周炎的

3、進程？目前尚未見相關(guān)報道。
　　本研究以體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞、外周血CD4+T細胞以及人牙周膜細胞和外周血CD4+T細胞共培養(yǎng)體系為實驗?zāi)Ｐ?，觀察尼古丁作用后人牙周膜細胞IL-1β、IL-6的變化，并進一步探討IL-1β、IL-6能否誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th17分化，以期闡明尼古丁和α7nAChR在吸煙相關(guān)性牙周炎中的作用機制。
　　第一部分人牙周膜細胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　主要方法：取12～15歲正常人因正畸治療拔

4、除的健康無齲第一前磨牙，無菌條件下刮取根中1/3牙周膜組織，組織塊法行人牙周膜細胞原代培養(yǎng)。常規(guī)傳代，取第五代細胞進行免疫組化染色，觀察角蛋白、波形絲蛋白表達，鑒定細胞來源。
　　主要結(jié)果：原代培養(yǎng)9天后組織塊周圍爬出呈長梭形的成纖維樣細胞，常規(guī)傳代后，鏡下見細胞密度均勻，鋪滿瓶底，呈放射狀排列；細胞呈長梭形，細胞漿均勻豐滿，核仁圓形且清晰。免疫組化結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞角蛋白染色陰性，波形絲蛋白染色陽性，證實其細胞來源為

5、間充質(zhì)。
　　主要結(jié)論：成功建立實驗?zāi)Ｐ?。所培養(yǎng)細胞來源于間充質(zhì)，系人牙周膜細胞。
　　第二部分尼古丁對體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞IL-1β、IL-6mRNA表達的影響
　　主要方法：以體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞為實驗?zāi)Ｐ?，通過PCR凝膠電泳實驗和實時定量PCR檢測α7nAChR激動劑尼古?。?0-5M）和/或拮抗劑α-BTX（10-8M）作用下人牙周膜細胞IL-1β、IL-6mRNA的表達。
　　主要結(jié)果：PCR凝膠電

6、泳結(jié)果顯示在目的條帶處獲得單一清晰條帶，相比于對照組，尼古丁組人牙周膜細胞IL-1β、IL-6mRNA表達明顯升高，其余各組無明顯變化；實時定量PCR顯示與對照組相比，尼古丁組IL-1β、IL-6mRNA表達明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余各組結(jié)果與對照組相近，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　主要結(jié)論：尼古丁和α7nAChR結(jié)合后，可明顯上調(diào)體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞合成的炎性因子IL-1β、IL-6mRNA的表達。

7、提示尼古丁可能通過α7nAChR上調(diào)人牙周膜細胞IL-1β、IL-6mRNA的表達而對牙周組織產(chǎn)生影響。
　　第三部分尼古丁對體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞、外周血CD4+T細胞IL-1β、IL-6蛋白表達的影響
　　主要方法：組織塊法體外培養(yǎng)人牙周膜細胞；密度梯度離心法和流式細胞儀分選及體外培養(yǎng)人外周血CD4+T細胞；利用Transwell小室構(gòu)建人牙周膜細胞與外周血CD4+T細胞體外共培養(yǎng)體系，建立三組實驗?zāi)Ｐ?。通過ELISA檢

8、測α7nAChR激動劑尼古?。?0-5M）和/或拮抗劑α-BTX（10-8M）作用下人牙周膜細胞、細胞共培養(yǎng)體系和CD4+T細胞IL-1β、IL-6蛋白的表達。
　　主要結(jié)果：在人牙周膜細胞和細胞共培養(yǎng)體系中，與對照組相比，尼古丁組IL-1β、IL-6蛋白表達明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余各組與對照組相近，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CD4+T細胞IL-1β、IL-6蛋白幾乎無表達，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0

9、.05）；尼古丁（10-5M）對三組實驗?zāi)Ｐ妥饔玫慕Y(jié)果顯示，人牙周膜細胞和細胞共培養(yǎng)體系IL-1β、IL-6蛋白的表達基本相近，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但遠遠高于CD4+T細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。
　　主要結(jié)論：共培養(yǎng)體系中IL-1β、IL-6蛋白是由人牙周膜細胞分泌的，CD4+T細胞幾乎無IL-1β、IL-6蛋白表達且對人牙周膜細胞IL-1β、IL-6蛋白表達沒有影響；尼古丁和α7nAChR結(jié)合后，可明顯

10、上調(diào)體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-6蛋白的表達，從蛋白水平驗證了第二部分實驗結(jié)果。提示尼古丁可能通過α7nAChR促進人牙周膜細胞分泌IL-1β、IL-6而對牙周組織產(chǎn)生影響。
　　第四部分尼古丁誘導(dǎo)人外周血CD4+T細胞向Th17細胞亞群分化的體外研究
　　主要方法：密度梯度離心法和流式細胞儀分選及體外培養(yǎng)人外周血CD4+T細胞；利用Transwell小室構(gòu)建人牙周膜細胞與外周血CD4+T細胞體外共

11、培養(yǎng)體系，建立兩組實驗?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^PCR凝膠電泳實驗和ELISA檢測α7nAChR激動劑尼古?。?0-5M）和/或拮抗劑α-BTX（10-8M）作用下細胞共培養(yǎng)體系和CD4+T細胞IL-17的表達。
　　主要結(jié)果：PCR凝膠電泳結(jié)果顯示無目的條帶出現(xiàn)，各實驗組均無IL-17mRNA表達；ELISA結(jié)果顯示各實驗組均無IL-17蛋白表達。
　　主要結(jié)論：本實驗條件下，尚不能證明尼古丁激活α7nAChR后刺激人牙周膜細胞分泌的IL