過表達葡萄糖轉運蛋白-2基因的INS-1細胞構建研究.pdf

1、研究目的:
　　 慢性胰腺炎患者由于反復的炎癥刺激,致胰島β細胞損傷逐漸加重,β細胞數目明顯減少,胰島功能顯著下降;同時長期高糖毒性作用亦可引起胰腺炎的反復發(fā)作,進一步加速胰島β細胞凋亡,從而最終發(fā)展為繼發(fā)性糖尿病。因此,控制高血糖是慢性胰腺炎后期治療的一個重要環(huán)節(jié),而目前的治療方法尚存在諸多弊端。傳統(tǒng)的體外胰島素注射治療,由于與胰島素分泌的生理模式不符,易致血糖波動而引起相關并發(fā)癥。細胞移植治療雖為研究熱點,但胰島β細胞分離與

2、儲存技術難度較大、代價昂貴,因此尋找新的移植細胞來源是該方法亟需解決的關鍵難題。本課題應用逆轉錄病毒載體將調節(jié)胰島素分泌的葡萄糖傳感器--葡萄糖轉運蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因轉染于INS-1細胞,使INS-1細胞的胰島素分泌更接近于生理條件,從而建成新型的“胰島代理細胞”系,為細胞移植治療提供新的、易供的移植細胞來源。
　　 研究背景:
　　 1、INS-1細胞源于輻射誘導的

3、胰島β細胞瘤,胰島素含量為8μg/106細胞,超過80代仍可穩(wěn)定表達,其胰島素含量與原代培養(yǎng)的胰島β細胞相似,同時該細胞自身無分泌胰高血糖素與生長抑素,更有助于在研究中排除其他因素對胰島素分泌的影響。
　　 2、胰島素分泌量與胰島β細胞內的葡萄糖代謝率成正比,故控制葡萄糖流入β細胞的蛋白或酶類被認為是調節(jié)胰島素釋放的葡萄糖傳感器,葡萄糖轉運蛋白-2(glucose transporter2,GLUT-2)就是β細胞內的葡萄糖傳感

4、器,其活性直接或間接受葡萄糖濃度調節(jié),從而改變葡萄糖在胰島β細胞內的代謝速率,進而調節(jié)胰島素的分泌。因此,通過GLUT-2基因轉染,可能實現對胰島素分泌的調控。
　　 3、逆轉錄病毒載體可攜帶靶基因于宿主細胞內長期、穩(wěn)定表達,并且其在一定間隔期內多次重復感染可提高基因轉染效率。因而,該載體是構建“胰島代理細胞”最常用的載體系統(tǒng)之一。
　　 第一部分 INS-1細胞GSIS檢測
　　 目的:對培養(yǎng)的INS-1細胞進

5、行葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulatedinsulin secretion,GSIS)檢測,從而掌握INS-1細胞的GSIS特點,為其改進奠定基礎。
　　 方法:(1)INS-1細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中;(2)對INS-1細胞進行GSIS檢測。
　　 結果:(1)INS-1細胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長良好;(2)GSIS檢測顯示INS-1細胞存

6、在胰島素分泌,但其胰島素分泌與生理模式存在顯著差異。
　　 結論:成功培養(yǎng)INS-1細胞,該細胞有成熟胰島素的分泌,但其GSIS與生理模式存在顯著差異。
　　 第二部分葡萄糖轉運蛋白-2基因逆轉錄病毒表達載體構建/包裝及鑒定
　　 目的:構建GLUT-2基因逆轉錄病毒表達載體pL-GLUT2-SN,并于PA317細胞中進行包裝,獲取高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉染INS

7、-1細胞奠定基礎。
　　 方法:(1)質粒pcB7/GLUT-2以EcoRI,BamH1雙酶切,獲得GLUT-2 cDNA,與同樣酶切的逆轉錄病毒載體pLXSN在T4DNA連接酶作用下連接,構建成重組逆轉錄病毒表達載體pL-GLUT2-SN,經酶切及測序鑒定;(2)Lipofectamine2000介導pL-GLUT2-SN轉染包裝細胞PA317,分別以PCR、RT-PCR對PA317/GLUT-2細胞中GLUT-2基因的整合與

8、轉錄進行檢測。
　　 結果:(1)構建的pL-GLUT2-SN重組載體經EcoRI、BamH1雙酶切有1996bp的GLUT-2 cDNA及5.9kb的載體片段,GLUT-2 cDNA序列經測序證實正確;(2)所獲穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,其最高病毒滴度可達7.1×105 CFU/mL;PA317/GLUT-2細胞RT-PCR擴增出158bp的目的片段;而PA317/pLXSN細胞檢測結果為陰性,證實在PA317

9、/GLUT-2細胞中已獲得GLUT-2基因的轉錄。
　　 結論:所獲GLUT-2 cDNA序列正確,成功構建了高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉染INS-1細胞奠定了基礎。
　　 第三部分過表達葡萄糖轉運蛋白-2基因的INS-1細胞構建及GSIS檢測
　　 目的:構建穩(wěn)定過表達GLUT2基因的INS-1細胞,并進行GSIS檢測。
　　 方法:(1)以GLUT2病毒感

10、染INS-1細胞,通過RT-PCR及Western-blot對INS-1/GLUT-2細胞中GLUT-2基因的轉錄及表達情況進行檢測;(2)對INS-1/GLUT-2細胞進行GSIS檢測。
　　 結果:(1)所獲INS-1/GLUT-2細胞經RT-PCR檢測顯示有更多的GLUT-2基因轉錄;(2)Western-blot證實INS-1/GLUT-2細胞中有GLUT-2基因過表達。(3)GSIS檢測顯示INS-1/GLUT-2細胞