

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、研究目的:
慢性胰腺炎患者由于反復的炎癥刺激,致胰島β細胞損傷逐漸加重,β細胞數目明顯減少,胰島功能顯著下降;同時長期高糖毒性作用亦可引起胰腺炎的反復發(fā)作,進一步加速胰島β細胞凋亡,從而最終發(fā)展為繼發(fā)性糖尿病。因此,控制高血糖是慢性胰腺炎后期治療的一個重要環(huán)節(jié),而目前的治療方法尚存在諸多弊端。傳統(tǒng)的體外胰島素注射治療,由于與胰島素分泌的生理模式不符,易致血糖波動而引起相關并發(fā)癥。細胞移植治療雖為研究熱點,但胰島β細胞分離與
2、儲存技術難度較大、代價昂貴,因此尋找新的移植細胞來源是該方法亟需解決的關鍵難題。本課題應用逆轉錄病毒載體將調節(jié)胰島素分泌的葡萄糖傳感器--葡萄糖轉運蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因轉染于INS-1細胞,使INS-1細胞的胰島素分泌更接近于生理條件,從而建成新型的“胰島代理細胞”系,為細胞移植治療提供新的、易供的移植細胞來源。
研究背景:
1、INS-1細胞源于輻射誘導的
3、胰島β細胞瘤,胰島素含量為8μg/106細胞,超過80代仍可穩(wěn)定表達,其胰島素含量與原代培養(yǎng)的胰島β細胞相似,同時該細胞自身無分泌胰高血糖素與生長抑素,更有助于在研究中排除其他因素對胰島素分泌的影響。
2、胰島素分泌量與胰島β細胞內的葡萄糖代謝率成正比,故控制葡萄糖流入β細胞的蛋白或酶類被認為是調節(jié)胰島素釋放的葡萄糖傳感器,葡萄糖轉運蛋白-2(glucose transporter2,GLUT-2)就是β細胞內的葡萄糖傳感
4、器,其活性直接或間接受葡萄糖濃度調節(jié),從而改變葡萄糖在胰島β細胞內的代謝速率,進而調節(jié)胰島素的分泌。因此,通過GLUT-2基因轉染,可能實現對胰島素分泌的調控。
3、逆轉錄病毒載體可攜帶靶基因于宿主細胞內長期、穩(wěn)定表達,并且其在一定間隔期內多次重復感染可提高基因轉染效率。因而,該載體是構建“胰島代理細胞”最常用的載體系統(tǒng)之一。
第一部分 INS-1細胞GSIS檢測
目的:對培養(yǎng)的INS-1細胞進
5、行葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulatedinsulin secretion,GSIS)檢測,從而掌握INS-1細胞的GSIS特點,為其改進奠定基礎。
方法:(1)INS-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中;(2)對INS-1細胞進行GSIS檢測。
結果:(1)INS-1細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長良好;(2)GSIS檢測顯示INS-1細胞存
6、在胰島素分泌,但其胰島素分泌與生理模式存在顯著差異。
結論:成功培養(yǎng)INS-1細胞,該細胞有成熟胰島素的分泌,但其GSIS與生理模式存在顯著差異。
第二部分葡萄糖轉運蛋白-2基因逆轉錄病毒表達載體構建/包裝及鑒定
目的:構建GLUT-2基因逆轉錄病毒表達載體pL-GLUT2-SN,并于PA317細胞中進行包裝,獲取高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉染INS
7、-1細胞奠定基礎。
方法:(1)質粒pcB7/GLUT-2以EcoRI,BamH1雙酶切,獲得GLUT-2 cDNA,與同樣酶切的逆轉錄病毒載體pLXSN在T4DNA連接酶作用下連接,構建成重組逆轉錄病毒表達載體pL-GLUT2-SN,經酶切及測序鑒定;(2)Lipofectamine2000介導pL-GLUT2-SN轉染包裝細胞PA317,分別以PCR、RT-PCR對PA317/GLUT-2細胞中GLUT-2基因的整合與
8、轉錄進行檢測。
結果:(1)構建的pL-GLUT2-SN重組載體經EcoRI、BamH1雙酶切有1996bp的GLUT-2 cDNA及5.9kb的載體片段,GLUT-2 cDNA序列經測序證實正確;(2)所獲穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,其最高病毒滴度可達7.1×105 CFU/mL;PA317/GLUT-2細胞RT-PCR擴增出158bp的目的片段;而PA317/pLXSN細胞檢測結果為陰性,證實在PA317
9、/GLUT-2細胞中已獲得GLUT-2基因的轉錄。
結論:所獲GLUT-2 cDNA序列正確,成功構建了高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉染INS-1細胞奠定了基礎。
第三部分過表達葡萄糖轉運蛋白-2基因的INS-1細胞構建及GSIS檢測
目的:構建穩(wěn)定過表達GLUT2基因的INS-1細胞,并進行GSIS檢測。
方法:(1)以GLUT2病毒感
10、染INS-1細胞,通過RT-PCR及Western-blot對INS-1/GLUT-2細胞中GLUT-2基因的轉錄及表達情況進行檢測;(2)對INS-1/GLUT-2細胞進行GSIS檢測。
結果:(1)所獲INS-1/GLUT-2細胞經RT-PCR檢測顯示有更多的GLUT-2基因轉錄;(2)Western-blot證實INS-1/GLUT-2細胞中有GLUT-2基因過表達。(3)GSIS檢測顯示INS-1/GLUT-2細胞
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 葡萄糖濃度波動對INS-1細胞線粒體呼吸鏈功能的影響.pdf
- 注射葡萄糖對軍曹魚糖代謝和葡萄糖轉運蛋白基因表達的影響.pdf
- 葡萄糖轉運蛋白-1在CD133+喉癌Hep-2細胞中的表達.pdf
- 慢性應激與波動性高糖誘導的大鼠胰島及INS-1細胞葡萄糖毒性.pdf
- 脂多糖對人腹膜間皮細胞葡萄糖轉運蛋白1表達的影響.pdf
- 4-苯基丁酸對成肌細胞葡萄糖轉運蛋白基因表達的影響.pdf
- 大鼠心肌活力改變與葡萄糖轉運蛋白4表達及葡萄糖代謝關系的研究.pdf
- 血管緊張素Ⅱ對大鼠系膜細胞葡萄糖轉運蛋白-1表達的影響.pdf
- 葡萄糖濃度波動誘導INS-1細胞氧化應激及凋亡的損傷機制的初探.pdf
- 創(chuàng)傷性腦損傷急性期高血糖對腦葡萄糖轉運蛋白1和葡萄糖轉運蛋白3表達的影響.pdf
- 幼齡糖尿病大鼠早期腎小管葡萄糖轉運蛋白2的表達研究.pdf
- 葡萄糖對大鼠肝細胞白蛋白基因表達的影響.pdf
- CASK過表達質粒的構建及其對INS-1細胞增殖及細胞周期的影響.pdf
- 高糖誘導INS-1細胞表達IL-1β及其損傷機制的研究.pdf
- 企鵝珍珠貝葡萄糖轉運蛋白1同源異構型基因的克隆及對葡萄糖應激的表達響應分析.pdf
- 葡萄糖轉運蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義.pdf
- 血管緊張素Ⅱ對腎小球足細胞葡萄糖轉運蛋白1的表達及易位的影響.pdf
- 肺癌中Ⅰ型葡萄糖轉運蛋白的表達及與葡萄糖攝取量間相關性的研究.pdf
- 高血糖對大鼠腎皮質葡萄糖轉運蛋白1mRNA表達的影響.pdf
- 高糖對INS-1細胞胰島素基因表達影響及PDTC的保護作用.pdf
評論
0/150
提交評論