RAPD技術在廣西產(chǎn)絞股藍遺傳特征及鑒別中的應用研究.pdf

1、采用RAPD分子標記技術對廣西區(qū)不同產(chǎn)地、不同來源的7份絞股藍材料進行了遺傳多樣性分析，并在DNA分子水平上鑒別絞股藍及其偽品烏蘞莓的新鮮品、干品，從而為絞股藍資源的分析收集、分類研究、多樣性保護、偽品鑒別，進而為藥用植物資源的育種工作和臨床安全用藥提供技術保障及分子生物學依據(jù)。主要研究結果如下： 1.采用改進的CTAB法成功提取了絞股藍和烏蘞莓新鮮品、干品DNA。 2.優(yōu)化了絞股藍的RAPD-PCR反應體系：主要以校園

2、采集的絞股藍DNA為模板，采用隨機引物WGS001進行PCR擴增，對反應體系包括模板、Mg2+、Taq酶、牛血清白蛋白(BSA)、退火溫度進行優(yōu)化。優(yōu)化的反應體系總體積25μL，含MgCl2 2 mmol/L、dNTP0.2 mmol/L、引物0.4μmol/L、模板60 ng、Taq酶1U、BSA 2μg/L。反應程序：預變性94℃ 3min，然后94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，40個循環(huán)，72℃延伸

3、10 min。 3.采用優(yōu)化了的RAPD-PCR反應體系，從10條含20個堿基的隨機引物中篩選出了2條具有多態(tài)性高且重復性好的引物對廣西區(qū)不同產(chǎn)地、不同來源的7份絞股藍新鮮品材料進行RAPD指紋圖譜研究。兩條引物共擴增出33個位點，多態(tài)位點30個，占90.91％，說明絞股藍種內具有豐富的遺傳多樣性。應用SPSS16.0軟件計算Jaccard遺傳相似系數(shù)并進行聚類分析。絞股藍植物間的相似性系數(shù)分布較廣，范圍為0.217～0.688

4、。聚類樹狀圖表明絞股藍親緣關系與地理距離相關，地理分布距離越近的樣品，在聚類樹狀圖上的距離越近，說明它們之間的遺傳背景差異越小，親緣關系越近，反之越遠。 4.應用篩選的兩條引物對廣西不同產(chǎn)地絞股藍及其偽品烏蘞莓的新鮮品和干品進行RAPD鑒別。根據(jù)DNA圖譜上的差異性條帶可以將絞股藍及其偽品烏蘞莓很好的區(qū)分開來。且兩條引物均能擴增出所有絞股藍新鮮品和干品共有而烏蘞莓沒有的特異DNA片段，WGS001擴增的特異片段約550bp，W

5、GS004擴增的特異片段約500 bp。初步認為可將這兩條特異DNA片段作為鑒別廣西產(chǎn)絞股藍與烏蘞莓的依據(jù)。 5.對用引物WGS004擴增7份絞股藍新鮮品共有特異DNA片段(約500 bp)進行克隆、測序、生物信息學分析。進行生物信息學分析后確定所克隆的7條DNA序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中未收錄，為新發(fā)現(xiàn)的序列。 本研究首次采用RAPD技術對廣西產(chǎn)絞股藍進行遺傳特征研究，為研究絞股藍遺傳多樣性提供了分子生物學