細菌氯霉素類藥物耐藥基因三重PCR檢測試劑盒研究與應(yīng)用.pdf

1、本研究選擇3個氯霉素類藥物耐藥基因(cat1、cmlA、flor)作為擴增目的基因建立了單重PCR檢測方法，應(yīng)用該方法篩選出了一株同時攜帶cat1、cmlA、flor三種耐藥基因的陽性菌株(SLPE3-1)以作為試劑盒陽性對照株。 本研究對氯霉素類藥物耐藥基因三重PCR反應(yīng)體系條件進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)體系為：在25ul體系中，10×PCRBuffer2.5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，dNTP(2.5mm

2、ol/L)4μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，上、下游引物(25mmol/L)cat10.2μl、cmlA0.9μl、flor0.4μl，模板2.5μl，滅菌去離子水9.8μl；最佳反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；然后進入循環(huán)：94℃變性50S、54℃退火1min、72℃延伸1min，共32個循環(huán)，最后72℃延伸5min。 本研究對試劑盒特異性、敏感性、重復(fù)性和保質(zhì)期進行了檢測試驗。結(jié)果表明：本試劑盒具特異性很強，只能特異性

3、擴增出待檢測的耐藥基因；具有很高的靈敏度(2.4～1.04CFU/mL)；具有很好的重復(fù)性(100％)；試劑盒在-20℃下的保質(zhì)期為6個月。應(yīng)用本檢測方法和藥敏試驗方法對33株細菌的耐藥性進行檢測，結(jié)果表明，兩者檢出結(jié)果的符合率為91％。 本研究應(yīng)用本試劑盒對全國21個省規(guī)?；B(yǎng)殖場收集的417株細菌進行了氯霉素耐藥基因(cat1、cmlA、flor)的檢測，結(jié)果顯示，各省的耐藥基因檢出率差異較大，三種基因的平均檢出率分別為：4