MSM人群中HIV感染者Tim-3受體及其配體Gal-9對(duì)NK細(xì)胞功能的影響.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩56頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染可引起以CD4+T細(xì)胞減少為主要特征的獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)。
  T細(xì)胞免疫球蛋白區(qū)和黏蛋白區(qū)(T cell immunoglobulin domain and mucin domain,Tim)基因家族包括3個(gè)成員:Tim-1、Tim-3和Ti

2、m-4。Tim-3主要表達(dá)在已分化的CD4+1型輔助性T細(xì)胞(Th1)和CD8+1型細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL),少量表達(dá)于Th17細(xì)胞。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞,尤其是在NK細(xì)胞有較高表達(dá)。Tim-3是T細(xì)胞重要的負(fù)性調(diào)控因子,可使T細(xì)胞功能減退進(jìn)而加重慢性病毒感染。在HIV感染中,Tim-3在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量增加,使病毒特異性CD8+T細(xì)胞的增殖和分泌細(xì)胞因子能力都降低,導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低和病毒載量的升

3、高。Tim-3的配體——半乳凝集素-9(galectin-9,Gal-9),是一種S型外源性凝集素,廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞,通過(guò)與Tim-3的結(jié)合誘導(dǎo)Tim-3+T細(xì)胞的死亡。盡管表達(dá)于T細(xì)胞的Tim-3可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞功能,但表達(dá)于固有免疫細(xì)胞的Tim-3在免疫調(diào)節(jié)方面的作用目前仍存在爭(zhēng)議。有研究顯示,表達(dá)在樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的Tim-3能夠增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。自然殺傷細(xì)胞(natrual killer cell,NK)屬于淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞

4、群,是固有免疫應(yīng)答中一類重要的效應(yīng)細(xì)胞,主要通過(guò)細(xì)胞毒性作用和分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用。HIV-1感染者外周血NK細(xì)胞胞內(nèi)儲(chǔ)存的穿孔素和顆粒酶A減少、活化與抑制性受體表達(dá)異常,使HIV感染者NK細(xì)胞細(xì)胞毒性下降從而影響機(jī)體對(duì)病毒的清除。目前,Tim-3對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生何種影響還不明確,Tim-3+NK細(xì)胞的研究?jī)H見(jiàn)幾篇報(bào)道,且局限在健康人群和慢性乙型肝炎等少數(shù)幾種疾病。在HIV感染中Tim-3及其配體Gal-9對(duì)NK細(xì)胞是否發(fā)揮

5、作用、作用機(jī)制如何以及對(duì)疾病進(jìn)展有何影響尚無(wú)明確結(jié)論,相關(guān)報(bào)道僅有2篇,有待更為系統(tǒng)性的深入研究。
  近年來(lái)MSM(men who have sex with men,MSM)人群中的HIV感染者已成為我國(guó)HIV新發(fā)感染主體,且此人群中HIV感染者疾病進(jìn)展較快。因此,本研究擬探索MSM人群中HIV感染者Tim-3及其配體Gal-9對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子(IFN-γ)分泌和脫顆粒(CD107a)功能的影響,為明確HIV感染的致病機(jī)制提

6、供依據(jù)。
  材料與方法:
  1、研究對(duì)象
  本研究共選取實(shí)驗(yàn)對(duì)象41例,其中,HIV抗體陰性的健康人13例;根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家HIV/AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇未接受過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV慢性感染者28例。
  (1) HIV抗體陰性健康人(HIV-negative normal control,NC):13例入選標(biāo)準(zhǔn):HIV抗體陰性健康人群,血常規(guī)及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性,無(wú)免

7、疫系統(tǒng)疾病。
  (2) HIV慢性感染者:28例
  入選標(biāo)準(zhǔn):均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門(mén)診MSM人群的HIV感染者,未接受HAART治療,感染時(shí)間一年以上。其中按CID4-T細(xì)胞數(shù)量高低分為兩實(shí)驗(yàn)組,其中CD4-T細(xì)胞數(shù)量大于350細(xì)胞/ul為高CD4組(CD4 high),小于350細(xì)胞/ul為低CD4組(CD4 low),高CD4組(CD4 high)15例,低CD4組(CD4 low)13例。
 

8、 2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)
  在絕對(duì)計(jì)數(shù)管中加入20ul CD4/CD8/CD3TriTEST試劑,再用逆向加樣法加入50ul混勻的待測(cè)抗凝全血,在室溫下避光染色15分鐘,然后加入1×BD免洗溶血素450ul,在室溫下避光溶血15分鐘,再用FACSCalibur流式細(xì)胞儀中的MultiSET軟件進(jìn)行檢測(cè)并自動(dòng)分析,獲得CD4+T細(xì)胞數(shù)量的絕對(duì)值。
  3、HIV病毒載量測(cè)定
  采用Roche公司The COBAS

9、(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@) TaqMan(@) HIV-1 Test,v2.0試劑盒在COBAS(@) TaqMan(@)系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測(cè)。檢測(cè)下限為20拷貝/ml。
  4、NK細(xì)胞Tim-3及其配體Gal-9表達(dá)的檢測(cè)
  用抗CD3-FITC、CD4-PEcy7、CD16-PerCP、CD56-PEcy7、Lineage-FITC(、HLA-DR-PerCP、Tim-

10、3-PE和Gal-9APC(或Gal9-PE)熒光抗體對(duì)凍存復(fù)蘇后的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行表面染色,室溫避光20分鐘,PBS洗滌一遍,用1%的多聚甲醛固定細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)NK細(xì)胞Tim-3與Gal-9表達(dá)、CD4+T細(xì)胞和DC細(xì)胞Gal-9表達(dá)情況,用LSRⅡ流式細(xì)胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。
  5、NK細(xì)胞功能的檢測(cè)
  將凍存復(fù)蘇后的PBMC稀釋后加入96微孔板,每孔100ul,再加入抗

11、CD107a-APC-H7和Brefeldin-A(1)ul/ml或Monensin0.7ul/ml,同時(shí)加入刺激物IL-12+IL-15(10ng/ul和50ng/ul)或PMA/ION或K562細(xì)胞,于二氧化碳(5%)培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞,用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE熒光抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面染色,然后破膜,熒光標(biāo)記單克隆抗體IFN-γ-APC胞內(nèi)染色,用1%的多聚甲醛固定

12、細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子(IFNγ)分泌及脫顆粒(CD107a)情況。用LSRⅡ流式細(xì)胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。
  6、Tim-3受體阻斷實(shí)驗(yàn)
  將凍存復(fù)蘇后的PBMC稀釋后加入96微孔板,每孔100ul,再加入抗CD107a-APC-H7和Brefeldin-A1ul/ml或Monensin0.7ul/ml,同時(shí)加入刺激物IL-12+IL15(10ng/ul和50ng/ul)及anti-Ti

13、m-3,于二氧化碳(5%)培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞,用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE熒光抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面染色,然后破膜,熒光標(biāo)記單克隆抗體IFN-γ-APC胞內(nèi)染色,用1%的多聚甲醛固定細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子(IFN-γ)分泌及脫顆粒(CD107a)情況。用LSRⅡ流式細(xì)胞儀中的BD FACSDivaTM軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。
  7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
  應(yīng)用SPSS17

14、.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  一、HIV感染后Tim-3受體在NK細(xì)胞的表達(dá)減少
  HIV組總NK細(xì)胞(Total NKcell)、CD56dimNK及CD56-CD16+NK細(xì)胞的Tim-3百分?jǐn)?shù)低于NC組(p=0.0224,p=0.0369,p=0.

15、0104),其中CD4低組Tim-3+TotalNK細(xì)胞、Tim-3+CD56dimNK細(xì)胞、Tim-3+CD56-CD16+ NK細(xì)胞及CD4高組Tim-3-CD56-CD16+NK細(xì)胞百分比低于NC組(p=0.0159,p=0.0483,p=0.0455,p=0.0166)。HIV組、CD4高組和CD4低組CD56-CD16+NK細(xì)胞的Tim-3平均熒光強(qiáng)度均低于NC組(p=0.0179,p=0.0404,p=0.0427)。

16、>  二、HIV感染后NK細(xì)胞分泌IFN-γ的功能降低
  總NK細(xì)胞分泌的IFN-γ百分?jǐn)?shù)中,NC組均高于HIV組、CD4高組和CD4低組(p<0.0001, p=0.0007, p=0.0003), Tim-3+NK細(xì)胞(p<0.0001, p=0.0007, p=0.0006)和Tim-3-NK細(xì)胞(p<0.0001,p=0.0027,p<0.0001)分泌IFN-γ百分?jǐn)?shù)也均呈此趨勢(shì)。
  三、阻斷Tim-3受體對(duì)N

17、K細(xì)胞分泌IFN-γ的影響無(wú)明顯變化
  使用anti-Tim-3單克隆抗體對(duì)正常人NK細(xì)胞Tim-3受體進(jìn)行體外阻斷實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷NK細(xì)胞Tim-3之后,細(xì)胞分泌IFN-γ的百分?jǐn)?shù)并無(wú)明顯變化。
  四、HIV感染后Gal-9在CD4+T細(xì)胞的表達(dá)增加
  HIV組、CD4高組和CD4低組Gal-9-CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于NC組(p<0.0001,p=0.0011,p<0.0001),且CD4低組高于CD4高

18、組(p=0.0106)。HIV感染者DC細(xì)胞Gal-9平均熒光強(qiáng)度也升高,且CD4低組高于NC組(p=0.0312)。
  五、HIV感染者CD4+T細(xì)胞Gal-9表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)
  Gal-9+CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(p=0.0343),與病毒載量呈正相關(guān)(p=0.0484),Gal-9在CD4+T細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與病毒載量(LgVL)呈正相關(guān)(p=0.0364)。所以我們認(rèn)為CD4+

19、T細(xì)胞Gal-9表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。
  六、HIV感染者CD4+T細(xì)胞Gal-9表達(dá)與NK細(xì)胞分泌IFN-γ功能呈負(fù)相關(guān)
  在HIV組、CD4高組和CD4低組Gal-9+CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均與總NK細(xì)胞分泌的IFN-γ百分?jǐn)?shù)均呈負(fù)相關(guān)(p=0.0007,p=0.0407,p=0.0019)。
  七、Tim-3-/+NK細(xì)胞功能特性研究
  1、細(xì)胞因子(IL-12+IL-15)刺激HIV感染者NK細(xì)胞

20、功能
  Tim-3+NK細(xì)胞和Tim-3(-)NK細(xì)胞均可分泌IFN-γ,且兩者分泌IFN-γ百分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異(p=0.9542)。但是,CD107a絕大部分由Tim-3-NK細(xì)胞釋放,且Tim-3-NK細(xì)胞釋放CD107a百分?jǐn)?shù)顯著高于Tim-3+NK細(xì)胞(p<0.0001)。因此我們認(rèn)為,細(xì)胞因子(IL-12+IL-15)刺激時(shí),Tim-3+NK細(xì)胞是一群能夠分泌IFN-γ但幾乎不具有脫顆粒(CD107a)功能的細(xì)胞。

21、r>  2、不同刺激物對(duì)健康人NK細(xì)胞功能的影響
  細(xì)胞因子(IL-12+IL-15)刺激后,Tim-3+NK細(xì)胞和Tim-3-NK細(xì)胞均可以分泌IFN-γ,而Tim-3+NK細(xì)胞不釋放CD107a,Tim-3NK細(xì)胞可以釋放CD107a。PMA刺激后,只有Tim-3NK細(xì)胞分泌IFN-γ并釋放CD107a。K562細(xì)胞刺激時(shí)后,大部分IFN-γ和CD107a由Tim-3-NK細(xì)胞分泌及釋放,少部分由Tim-3+NK細(xì)胞分泌及釋

22、放。采用不同濃度PMA刺激后,Tim-3+NK細(xì)胞百分比隨PMA濃度增大而減少,IFN-γ+Tim-3-NK細(xì)胞百分比隨PMA濃度增大而增大,而Tim-3+NK細(xì)胞幾乎不分泌IFN-γ,且IFN-γ+Tim-3+NK細(xì)胞百分比隨PMA濃度增大無(wú)變化。
  結(jié)論:
  1、HIV感染者總NK細(xì)胞、CD56dimNK及CD56-CD16+NK細(xì)胞的Tim-3百分?jǐn)?shù)低于正常對(duì)照。
  2、HIV感染者NK細(xì)胞分泌IFN-γ能

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論