以小耳殘耳軟骨細胞為種子細胞的組織工程軟骨的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:小耳殘耳軟骨細胞的體外培養(yǎng)及生物學特性研究 目的:研究人的小耳殘耳軟骨細胞體外培養(yǎng)的方法及細胞的生物學特性。 方法:取5~6歲小耳畸形患者的殘耳軟骨,采用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化后,接種于含有胎牛血清的Ham F-12培養(yǎng)基,進行體外培養(yǎng),同時觀察其形態(tài)學改變。采用Ⅱ型膠原抗體的免疫組化染色進行細胞來源的鑒定,RT-PCR檢測各代細胞Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA的表達。 結果:體外培養(yǎng)的小耳殘耳

2、軟骨細胞的原代和早期傳代細胞以多角形或者三角形為主,隨著傳代次數(shù)的增加,細胞逐漸變?yōu)殚L梭形,到第5代時,幾乎全部轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮渭毎6遗c正常耳廓軟骨細胞相比,小耳殘耳軟骨細胞去分化的現(xiàn)象更為顯著。第1-3代軟骨細胞的Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陽性。在第1~2代細胞中,Ⅱ型膠原和Aggrecan的mRNA表達水平較強,隨傳代次數(shù)增加,表達逐漸減弱,至第4代基本消失。 結論:體外培養(yǎng)的第1~2代小耳畸形患者的殘耳軟骨細胞可作為組織工程軟

3、骨的種子細胞。 第二部分:不同年齡患者的小耳殘耳軟骨細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性研究 目的:觀察年齡因素對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞生物學特性的影響。 方法:取不同年齡組小耳畸形患者的殘耳軟骨,分離出軟骨細胞并進行培養(yǎng),觀察其形態(tài)學改變,測定細胞群體培增的時間。Ⅱ型膠原抗體的免疫組化染色進行細胞來源的鑒定。采用RT-PCR對各年齡組小耳殘耳軟骨細胞的Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA表達進行檢測,并進行比較。

4、 結果:各年齡組小耳畸形患者的殘耳軟骨細胞在細胞形態(tài)、細胞倍增時間、Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA的表達方面均無顯著差異。體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞隨著傳代次數(shù)的增加,從多角形逐漸變?yōu)殚L梭形。到第5代時,幾乎全部轉(zhuǎn)變成梭形細胞。細胞倍增時間顯示,各年齡組的第1~3代細胞有旺盛的增殖力。各年齡組第1~3代細胞的免疫組織化學染色均為陽性,1代和第2代細胞的Ⅱ型膠原和Aggrecan的mRNA表達水平相對較高,第3代的表達明顯下降,

5、第4代起均不表達。 結論:體外培養(yǎng)的人小耳殘耳軟骨細胞的生物學特性不因年齡不同(6~30歲)而改變,各年齡段(<30歲)的第1和第2代小耳殘耳軟骨細胞可作為軟骨組織工程的種子細胞。 第三部分: 堿性成纖維細胞生長因子在小耳殘耳軟骨細胞體外培養(yǎng)中的作用 目的:觀察堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞增殖的影響。 方法:取小耳畸形患者的殘耳軟骨,用含5 ng/ml、10 ng/ml

6、、25 ng/ml和50 ng/ml4種濃度b-FGF的Ham F-12培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。采用MTT法觀察b-FGF對細胞增殖的影響,RT-PCR法檢測b-FGF對體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞Ⅱ型膠原和Aggrecan分泌方面影響。 結果:在含有b-FGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞呈現(xiàn)成纖維細胞樣貼壁生長,細胞的增殖速度明顯加快(P<0.05),但在10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml3種不同濃度b-FGF

7、組之間,細胞增殖無顯著差異(P>0.05),RT-PCR結果顯示,各組的第3代軟骨細胞仍存在Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達。 結論:b-FGF能夠促進體外培養(yǎng)的小耳殘耳軟骨細胞增殖,在2代之內(nèi),細胞的表型和功能并沒有改變。10 ng/ml為b-FGF在小耳殘耳軟骨細胞體外培養(yǎng)中的最佳濃度。 第四部分:小耳殘耳軟骨細胞為種子細胞的組織工程軟骨的實驗研究 目的:探討利用小耳畸形患者的殘耳軟骨細胞為種子細胞,在裸鼠體

8、內(nèi)構建組織工程軟骨的可行性。 方法:獲取小耳畸形患者的殘耳軟骨,并以正常耳廓軟骨作為對照,用含10 ng/ml b-FGF的培養(yǎng)液分別進行體外培養(yǎng)。將體外培養(yǎng)擴增的第2代小耳殘耳軟骨細胞以及正常耳廓軟骨細胞以50×106/ml的濃度與30%的Pluronic F-127混勻,分別注入到裸鼠的皮下,在8周時將標本分離取出,通過大體觀察、組織學、免疫組織化學染色等方法對新生成的軟骨進行初步的評價。 結果:組織學檢測顯示,兩種

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