中國人HCV1b型雙順反子亞基因組復制子的構建.pdf

1、背景和目的：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界范圍內的重要傳染病之一。據(jù)估計，目前全世界約有1億7千萬HCV感染者，其中55-85％發(fā)展成慢性丙型肝炎，在10~20年中又有20％～50％進展成肝硬化，1％～4％發(fā)展成肝細胞肝癌，所以丙型肝炎為一全球性嚴重危害人民健康的疾病。目前對HCV的預防和治療十分有限，迄今還沒有疫苗問世。HCV感染者最有效的治療方法為聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋

2、林，持續(xù)病毒學應答率可達54％～56％，但該療法對基因型有很強的依賴性，即不同的基因型對治療反應差異很大。此外，其治療費用頗高，且具有顯著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治療方法?？笻CV藥物開發(fā)的主要障礙在于缺乏高效的體外HCV復制細胞模型和小動物模型。HCV感染性分子克隆的體外轉錄物在黑猩猩體內獲得有效的復制，而在人肝癌細胞系中復制效率較低。近年報道的選擇性雙順反子(cistron:編碼一個蛋白質的一個DNA單位)亞基因組HCVR

3、NA復制子(replicon:基因組中一個能被獨立復制的DNA片段單位)系統(tǒng)為HCV致病機理研究及抗病毒藥物評價提供了一個新的途徑。 HCV是黃病毒家族成員之一，基因組為單鏈正義RNA，長約9.6kb，HCV基因組具有明顯的異質性，根據(jù)其核基酸( nucleotide，nt)序列的差異，分為6個主要的基因型(30-50％ nt差異)，50多個亞型(10-30％ nt差異)及不同的HCV分離株(5-15％ nt差異)，此外，HC

4、V以一群不同的但密切相關的變異株存在于患者體內，稱為準種( Quasispecies)。不同國家、不同地區(qū)的主要型別是不同的。在全球范圍內，1-3型最為常見，1a在南美、北美、歐洲和亞洲占優(yōu)勢，1b型在北美、歐洲以及亞洲的一些地區(qū)較為多見，2a和2b型多分布于發(fā)展中國家，但是其流行程度次于1型。因此，采用HCV分型的“金標準”法-核苷酸序列分析法調查中國人HCV基因型的分布狀態(tài)，以獲得中國人的HCV流行株，對于復制子的構建以及后期抗病毒

5、藥物的篩選和評價具有重要意義。此外，由于HCV基因組富含GC且具有復雜的二級結構，長鏈的擴增比較困難，國內外大多數(shù)HCV全長基因組質粒采用短鏈RT-PCR方法制備，涉及到許多亞基因組cDNA片段的克隆和連接，這種短片斷的拼接很容易造成準種間的不同變異株的重組擴增和不真實連接，使所構建的HCV全基因組并不是實際存在的基因序列，限制了HCV分子水平的研究。同時最近研究顯示，HCV3’非編碼區(qū)(3'non-translated region，

6、3'UTR)是HCV基因組包裝和復制不可缺少的重要成分。HCV3'UTR位于HCV3'末端，包括一個基因型特異的多變區(qū)(不同基因型之間具有核苷酸序列的差異)、長度不一的多聚嘧啶區(qū)( poly U)及一段高度保守的98個堿基的區(qū)域，稱為X-tail。研究顯示完整的3'UTR才能發(fā)揮正常作用，不同型別甚至同型別不同株型間3'UTR的互換都會導致HCV RNA無法復制，刪除整個poly U或X-tail或X-tail中任何一個莖環(huán)均可徹底阻斷

7、HCV RNA復制。因此采用長鏈RT-PCR方法構建包括完整3'UTR的HCV全長基因組質粒可最大限度地避免準種間不真實連接，為HCV分子水平的研究提供更為真實可靠的研究平臺。 本研究收集西南地區(qū)HCV感染者的血液標本及臨床資料，建立了HCV的標本庫；采用HCV核苷酸序列分型法(sequence analysis)和系譜分析法(phylogenetic analysis)對西南地區(qū)206例HCV感染者進行基因分型，了解HCV的主

8、要流行基因亞型；用主要流行株感染的血清及兩片段法逆轉錄巢式PCR( RT-nested PCR)來構建HCV全長基因組；以該全長質粒為模板，擴增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3-5B中HCV非結構蛋白序列，構建中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復制子質粒；體外轉錄合成RNA，將其轉染Huh7細胞，并進行G418篩選，然后對集落細胞HCV復制子復制能力及蛋白表達進行檢測。 材料和方法：

9、 1.HCV感染患者血清標本庫的建立：從2004年開始，我們系列地收集了西南醫(yī)院傳染科門診及住院的HCV感染患者血液標本。所有血清標本進行基本的生化和病毒學檢測。記錄每一位患者的流行病學資料和臨床與診斷檢測結果。定期隨訪，不斷擴充標本庫。同時，對大部分HCV RNA陽性血清標本進行HCV基因型別的檢測，以GenBank中所有HCV全長序列為參照序列，設計引物，擴增HCV C區(qū)基因的羧基端至El區(qū)基因的氨基端長度為474bp的片段，測定其

10、核苷酸序列，與GenB ank中已知的HCV序列進行系譜分析，進行HCV基因型和亞型的確定。 2.HCV長鏈RT-PCR擴增方法的建立和優(yōu)化：選擇病毒含量較高的患者血清標本進行5'和3'半基因組擴增。以GenB ank中所有HCV全長序列為參照序列，選擇相對保守，GC含量適中的區(qū)域設計RT引物和PCR擴增引物，由于3'半基因組擴增難度較大，特別設計了6條正向引物和2條反向引物。通過對HCV RNA提取方法的篩選、三種RT酶及RT

11、條件，以及PCR引物、不同高保真Taq酶、循環(huán)體系、循環(huán)條件的比較和優(yōu)化，建立HCV長鏈RT-PCR擴增方法。 3.中國人HCV雙順反子亞基因組復制子的構建：選擇一例1b型且HCV RNA含量較高的血清標本，通過優(yōu)化的RT-PCR擴增方法及融合PCR方法獲得HCV全長基因組片斷，TA克隆，轉化感受態(tài)細胞獲得HCV全長基因組質粒。以該全長質粒為模板，擴增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3- SB中HCV

12、非結構蛋白序列，構建中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復制子質粒。提取復制子質粒DNA，Xba I限制性內切酶對其酶切線性化，體外轉錄合成RNA，轉染Huh7細胞，并進行G418篩選，獲得抗性克隆。提取克隆細胞的RNA和蛋白，進行短鏈RT-PCR、間接免疫熒光法及Western blot檢測HCV復制子是否進行了有效復制及蛋白表達。 主要結果： 1.建立了中國人HCV標本庫：至今為止，已收集605例HCV慢性感染

13、患者的934份血清標本。完整記錄了流行病學、臨床及實驗室資料，可提供研究所需的血清標本。對206份HCV RNA陽性感染者血清標本進行了基因型別的檢測。序列與系譜分析結果顯示1b87例，占42.2％，2a26例，占12.6％，3a32例，占15.5％，3b30例，占14.6％，6a31例，占15.1％，未見1a和2b型，1b為我國流行的主要基因型。 2.建立了HCV長鏈RT-PCR擴增方法：選擇SuperScriptTM IIR

14、Nase H-逆轉錄酶和Platinum Taq DNA高保真Taq酶以及最佳的逆轉錄和PCR反應條件可成功實現(xiàn)HCV5'端和3'端半基因組的擴增。HCV5'端半基因組擴增較為穩(wěn)定，通常HCV RNA定量>106的血清標本擴增均可獲得陽性條帶，目的條帶亮度高，特異性好；3'端半基因組擴增重復性和靈敏度有待進一步提高。 3.成功地構建了中國人HCVlb型選擇性雙順反子亞基因組RNA復制子：通過優(yōu)化的RT-PCR及融合PCR方法獲得

15、了HCV全長基因組片斷及質粒，CE1和3'端短鏈擴增均可獲得陽性結果。以該全長質粒為模板，擴增獲得完整的HCV NS3至3'UTR長片斷，替代pNNeo/3-5B中HCV非結構蛋白序列，成功構建了中國人HCV株選擇性雙順反子亞基因組RNA復制子質粒。質粒DNA體外轉錄合成得到RNA，電泳顯示片斷大小正確，濃度較高。將其轉染Huh7細胞，G418篩選，經過45天左右的時間，獲得G418抗性克隆。RT-PCR可以獲得陽性條帶，證明復制子RN

16、A可以在細胞內進行復制；間接免疫熒光及Western blot檢測均獲得陽性結果，表明有HCV NS3和NS5A蛋白表達，結果證明中國人HCV亞基因組復制子構建成功。 主要結論： 1.建立了中國人HCV標本庫。為HCV的基礎與臨床研究奠定了良好的基礎。 2.建立了HCV長鏈RT-PCR擴增方法。、為HCV全基因組質粒及體外復制子模型的構建奠定了基礎，也為其他RNA病毒的長鏈擴增提供了參考。 3.成功建立了