環(huán)核苷酸磷酸二酯酶八型（PDE 8）催化結構域的表達、復性和晶體結構研究.pdf

1、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶八型(PDE8)是環(huán)核苷酸磷酸二酯酶家族中cAMP底物特異性的同工酶之一，在多種生理過程中起重要作用，并與腎上腺皮質增生等疾病有關。由于大量制備純化PDE8十分困難，目前尚無文獻報道PDE8催化結構域的晶體結構。為了深入揭示PDE8的催化水解機理及其與抑制劑之間的相互作用，本文經(jīng)過系統(tǒng)性研究，首次成功地在E.coli中過表達出變性PDE8A1催化結構域片段(氨基酸序列480-820)，并用直接稀釋法復性，得到大量高活性

2、、純度大于95％的PDE8A1(480-820)；用酶促反應動力學表征復性出的PDE8A催化結構域片段；獲得了三個蛋白質晶體并通過X射線衍射測定其結構。三個蛋白質晶體及其分辨率分別為：PDE8A1(480-820)晶體(分辨率為1.9A)、PDE8A1(480-820)-IBMX復合物晶體(分辨率為2.1A)、PDE8A1(480-820)-Dipyridamole復合物晶體(分辨率為1.95A)。 通過酶促反應動力學對復性PD

3、E8A1(480-820)進行表征，發(fā)現(xiàn)以cAMP為底物，在含有10mMMgCl2的緩沖液中，復性PDE8A1(480-820)的KM為7.0±0.1μM，kcat為2.9±0.1s-1；在含有4mMMnCl2的緩沖液中，其KM為1.8±0.1μM，kcat為4.0±0.1s-1。復性PDE8A1(480-820)與文獻報道全長PDE8A1相比，其KM為后者的7-45倍。用同樣的方法復性PDE8A1(205-820)并測得其KM為0.2

4、8μM，因此推測PDE8A1的N端PAS結構域可能對PDE8A1的催化活性起調節(jié)作用。本文還測定了IBMX和Dipyridamole對復性PDE8A1(480-820)的IC50分別為698±29μM和6.0±0.4μM。 從晶體結構中發(fā)現(xiàn)：PDE8A1催化結構域由18個α螺旋組成，并含有兩個金屬離子，其整體結構與其它已知的PDE同工酶催化結構域極為相似。本文由復性PDE8A1(480-820)的結構出發(fā)，結合酶促反應動力學研究

5、和已有的文獻報道，對PDE8A1催化結構域的催化水解機理進行了推測。與其它已知的PDE同工酶催化結構域晶體結構進行對比，發(fā)現(xiàn)PDE8A1Gln778的構象未直接被其它氨基酸殘基所固定，而是分別通過兩個水分子與Ser745和Trp813連接，其構象比其它PDE同工酶中相應位置的谷氨酰胺殘基的自由度高，并且在不同條件下Gln778的構象可能有所差異。本文還詳細研究了復性PDE8A1(480-820)與IBMX的相互作用。結果表明Tyr748