番茄胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶同源SlMET1基因的功能初探.pdf

1、真核生物中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要手段之一，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能則是在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上共價結(jié)合一個甲基基團(tuán)，從而調(diào)控對應(yīng)基因的表達(dá)。DNA METHYLTRANSFERASE1(MET1)作為一種重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，影響著整個基因組的甲基化水平。研究表明，擬南芥Atmet1突變體在孢子體時期有多向形態(tài)學(xué)缺陷，包括開花延遲、畸形胚胎和種子不育，這些都是由于生殖細(xì)胞中的低甲基化導(dǎo)致的;在水稻中，破

2、壞OsMET1-2基因會導(dǎo)致一系列水稻生長發(fā)育的缺陷。同時MET1蛋白家族在多數(shù)真核生物中是保守的，由此可見MET1對植物生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。本課題組以及前人的研究發(fā)現(xiàn)紫外損傷DNA結(jié)合蛋白(DDB1)以表觀遺傳的方式調(diào)控細(xì)胞分裂、果實(shí)發(fā)育以及葉片光和色素的代謝合成。其中研究表明CUL4-DDB1 E3連接酶可以通過組蛋白甲基化作用來調(diào)節(jié)DNA甲基化。
　　本研究通過生物番茄數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics Network

3、，SGN）找到與擬南芥胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶MET1同源性較高的序列，即番茄SlMET1。通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆該基因并將其構(gòu)建為植物過量表達(dá)載體pBI121∷ SlMET1，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將SlMET1基因?qū)胍吧头鸦蚪M中，篩選得到穩(wěn)定的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株，將其作為遺傳材料研究SlMET1基因的功能。同時分析SlMET1在番茄中的表達(dá)模式，同時構(gòu)建綠色熒光瞬時表達(dá)載體pART27∷SlMET1-GFP，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草瞬時表

4、達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，確定SlMET1在細(xì)胞中的表達(dá)位置;在該系統(tǒng)中共同表達(dá)SlMET1與DDB1，研究SlMET1與DDB1間的相互關(guān)系。
　　研究結(jié)果表明，實(shí)時定量PCR分析SlMET1基因在野生型番茄果實(shí)和植株的各個時期和組織中都有表達(dá);其中，葉片和花中表達(dá)量較高，在果實(shí)的變色期和紅果時期表達(dá)量較低。通過綠色熒光融合蛋白載體的表達(dá)，確定SlMET1基因只在番茄細(xì)胞核中表達(dá)。通過免疫共沉淀分析，確定SlMET1和DDB1之