毛囊源性干細胞成牙能力的實驗研究.pdf

1、牙齒的發(fā)生和發(fā)育是在上皮-間充質(zhì)相互作用的精確調(diào)控下完成的，這也提示我們在選擇種子細胞的時候也必須同時考慮兩種細胞，即上皮細胞和間充質(zhì)細胞。目前發(fā)現(xiàn)的有望應用于牙組織工程的細胞大部分源自牙本身，如牙髓干細胞與脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、根尖牙乳頭干細胞等。在非牙源性成體干細胞方面，目前僅發(fā)現(xiàn)骨髓來源的細胞具有成牙潛能，而且必須依靠胚胎期的誘導條件才能分化為牙齒形成細胞。利用非牙源性細胞實現(xiàn)牙齒再生面臨種子細胞匱乏、誘導條件短缺的窘

2、境，而在成體中尋找適用于釉質(zhì)再生的干細胞一直都是牙齒再生的瓶頸問題。毛囊是近年來干細胞研究的熱點，毛囊中包含上皮和間充質(zhì)兩種來源的干細胞。本研究從成體干細胞可塑性和干細胞定向分化微環(huán)境兩個方面入手，探討利用毛囊來源的干細胞進行牙齒再生的可能性，得出的主要結論如下：
　　1.毛囊真皮細胞的分離培養(yǎng)與干細胞生物學特性研究
　　采用酶消化聯(lián)合機械分離的方法成功在體外培養(yǎng)了具有較強增殖能力和克隆形成能力的毛囊真皮鞘細胞和毛乳頭細胞。

3、通過對其可塑性的研究證實真皮鞘細胞和毛乳頭細胞中包含具有多向分化能力的干細胞。但是這些干細胞具有異質(zhì)性，缺乏特異性表面標志物，難以有效分選。而含有干細胞的混雜細胞可以用來進行干細胞定向分化研究，未經(jīng)純化的毛囊真皮細胞在成脂、成骨誘導條件下，其中的所包含的干細胞表現(xiàn)出成脂和成骨潛能。在相同的成骨誘導條件下，毛乳頭細胞的堿性磷酸酶活性比真皮鞘細胞更強，因此可能更適用于硬組織再生。
　　2.毛乳頭間充質(zhì)干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞
　

4、　在出生后小鼠下頜切牙根尖蕾牙胚細胞與毛乳頭間充質(zhì)干細胞混合共培養(yǎng)體系中，來自根尖蕾上皮的成牙信號能夠促使毛乳頭間充質(zhì)干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞，說明誘導非牙源性干細胞成牙的微環(huán)境可以脫離發(fā)育早期牙胚的限制。在根尖蕾牙胚細胞條件培養(yǎng)液誘導下，毛乳頭間充質(zhì)細胞的形態(tài)和細胞周期明顯改變并表達Dspp和Dmp1基因，說明來自根尖蕾細胞的上皮信號也能啟動毛乳頭間充質(zhì)細胞的牙向分化。
　　3.毛乳頭間充質(zhì)干細胞構建牙髓牙本質(zhì)復合體的實驗研究<

5、br>　　為了研究利用非牙源性干細胞在脫離牙胚組織的條件下構建組織工程牙齒的可能性，我們將把經(jīng)過根尖蕾牙胚細胞條件培養(yǎng)液誘導的毛乳頭間充質(zhì)細胞團進行體內(nèi)移植后，僅形成骨樣組織。我們將根尖蕾牙胚細胞條件培養(yǎng)液結合到脫蛋白牙本質(zhì)片制成的支架材料上，種子細胞以細胞團的形式與支架材料進行復合后體內(nèi)移植。取材結果顯示，在結合在支架材料上的條件培養(yǎng)基的作用下，對照組的牙髓干細胞可以分化為成牙本質(zhì)細胞，規(guī)則地排列在支架材料表面，并且形成管狀牙本質(zhì)。毛

6、乳頭細胞只在支架材料表面形成少量無定形基質(zhì)。這一結果也說明僅僅依靠信號分子的作用不能實現(xiàn)非牙源性細胞分化為成熟的成牙本質(zhì)細胞。
　　4.毛囊表皮干細胞應用于釉質(zhì)再生的可能性
　　利用組織塊法成功了培養(yǎng)毛囊上段的外根鞘細胞，這些細胞的自我更新能力強，呈克隆樣生長，表達表皮干細胞的表面標志物β1整合素和角蛋白19，具有典型的表皮干細胞特征。在此基礎上，我們利用E17胎鼠下頜第一磨牙牙乳頭和出生后7天C57BL/6GFP小鼠下頜切

7、牙根尖蕾間充質(zhì)，分別與E17胎鼠表皮和體外培養(yǎng)的毛囊表皮干細胞進行重組，結果顯示，E17胎鼠下頜第一磨牙牙乳頭與生后7天C57BL/6GFP小鼠下頜切牙根尖蕾間充質(zhì)均具有誘導E17胎鼠表皮分化為成釉細胞的能力，但是沒有充分的證據(jù)表明體外培養(yǎng)的毛囊表皮干細胞在這兩種誘導條件下可以分化為成釉細胞。
　　綜上所述，本研究首次證實了毛乳頭間充質(zhì)干細胞在小鼠下頜切牙根尖蕾上皮信號的誘導下能夠分化為成牙本質(zhì)細胞，但是仍無法在脫離牙胚組織的條件