5-FU-殼聚糖納米粒的制備、檢測及其對卵巢癌細胞的抑制作用.pdf

1、殼聚糖(chitosan,CTS)是由甲殼素脫乙?；?化學名:(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。由于殼聚糖來源豐富,具有無免疫原性、無毒性、無溶血效應、無刺激性、無熱源反應,以及良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性、抗腫瘤作用等,使其作為化療藥物載體受到了廣泛的關注,被認為是一種極具應用前景的藥物載體。
　　5-氟尿嘧啶(5-FU)屬抗細胞代謝類抗癌藥,其抗瘤譜較廣,可用于治療消化道腫瘤、乳腺癌、皮膚癌、肺

2、癌、宮頸癌、膀胱癌及卵巢癌等。近幾年,許多學者致力于殼聚糖的抗腫瘤作用以及將其作為抗腫瘤藥物載體的研究。本實驗以殼聚糖納米粒作為藥物載體,制備成5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒(5-FU-CN)緩釋劑,檢測其一般特性,并檢測其抗卵巢癌細胞作用。
　　目的:
　　1.摸索制備5-FU-CN的實驗條件,制備5-FU-CN并檢測其一般特性。
　　2.檢測5-FU-CN對卵巢癌A2780細胞增殖能力的影響。
　　3.檢測5-F

3、U-CN對卵巢癌A2780細胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1.利用離子凝膠法制備5-FU-CN,摸索不同的CTS與多聚磷酸鈉(TPP)質量比,不同質量濃度的CTS溶液,及不同CTS與5-FU質量比對反應體系的影響。利用掃描透射電鏡,負染條件下觀察CN及負載不同質量5-FU的殼聚糖納米粒的外形特征。利用體外透析的方法,檢測裸藥5-FU和5-FU-CN的釋放特點。
　　2.利用倒置顯微鏡觀察5-FU-CN作用于卵巢癌A2

4、780細胞后對細胞形態(tài)的影響;利用MTT法,檢測5-FU-CN對A2780細胞的生長抑制作用,并與裸藥5-FU和空白殼聚糖納米粒(CN)進行比較;利用流式細胞儀檢測5-FU-CN作用于A2780細胞后,對其細胞周期分布的影響;利用免疫細胞化學的方法檢測5-FU-CN對A2780細胞PCNA表達的影響。
　　3.利用流式細胞儀檢測5-FU-CN作用于A2780細胞后,對細胞凋亡的影響;利用TUNEL法進一步檢測5-FU-CN對細胞凋

5、亡的影響;利用RealTimePCR方法檢測CN對A2780細胞凋亡相關基因(caspase-3,caspase-8,bax,bcl-2)的影響。
　　結果:
　　1.固定CTS的濃度為1mg/mL,隨著CTS與TPP質量比的增加,反應體系混合液逐漸渾濁,同樣固定CTS與TPP的質量比為5:1,隨著CTS溶液質量濃度的增加,反應體系溶液出現(xiàn)絮凝、甚至出現(xiàn)渾濁。根據(jù)對反應條件的摸索,制備CN及5-FU-CN時,選擇CTS的質量

6、濃度為5mg/mL,CTS與TPP的質量比為5:1,CTS與5-FU的質量比為1:1。用透射電子顯微鏡觀察,CN為規(guī)則的圓形,表面光滑,其粒徑大小在30~60nm范圍內,具有良好的穩(wěn)定性和分散性。包埋5-FU后,納米粒的粒徑隨著所含5-FU質量比例增大而增大,且粒徑的分布范圍變大。體外透析實驗證明:裸藥5-FU不存在緩釋效應,而負載于殼聚糖納米粒后,5-FU-CN具有一定的緩釋效應,緩釋時間可長達120h左右。
　　2.倒置顯微鏡

7、下觀察,5-FU-CN作用于A2780細胞后,出現(xiàn)細胞數(shù)量減少,胞質濃縮,部分細胞體積明顯縮小,輪廓不規(guī)則,生長緩慢,隨著作用時間的延長,出現(xiàn)多數(shù)細胞死亡。MTT實驗顯示5-FU-CN對A2780細胞具有一定的生長抑制作用,且呈濃度-時間依賴性。與裸藥5-FU相比,在藥物作用24h之前,5-FU-CN對人卵巢癌細胞A2780細胞的生長抑制作用弱于裸藥5-FU,但在24h之后,5-FU-CN對腫瘤細胞的生長抑制作用強于裸藥5-FU,且差異

8、具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。間接證明了5-FU-CN的緩釋作用。5-FU-CN能夠明顯抑制A2780細胞內增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達(P<0.05)。與此同時5-FU負載于殼聚糖納米粒后,使處于S期細胞比例下降,G1期細胞比例增加,隨著時間的延長,5-FU-CN將細胞抑制于G1期的作用更加明顯。
　　3.流式細胞儀及TUNEL法檢測結果均證明:5-FU-CN能誘導A2780細胞發(fā)生凋亡。裸藥5-FU與5-FU-CN相比

9、,在作用24h,5-FU誘導細胞凋亡的能力強于5-FU-CN,在作用48h,5-FU-CN誘導細胞凋亡的能力超過5-FU,且具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。5-FU-CN能夠上調A2780細胞中caspase-8、caspase-3、baxmRNA表達量,下調bcl-2mRNA表達量。雖然5-FU-CN對基因的調控速度相對裸藥5-FU較慢,但是其調控能力強大,且作用持久。
　　結論:
　　1.利用離子凝膠法,選擇殼聚糖的質量

10、濃度為5mg/mL,殼聚糖與多聚磷酸鈉的質量比為5:1,殼聚糖與5-氟尿嘧啶的質量比為1:1,能夠制備出穩(wěn)定性及分散性好、粒徑分布均一的納米粒。
　　2.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒中的5-氟尿嘧啶具有藥物緩釋性能,其緩釋過程分為突釋階段和緩釋階段兩部分,緩釋時間可持續(xù)120個小時左右。
　　3.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒對卵巢癌A2780細胞具有生長抑制作用,呈現(xiàn)濃度-時間依賴性,且其抗腫瘤作用明顯強于裸藥5-氟尿嘧啶及空白

11、殼聚糖納米粒。雖然5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒對A2780細胞的生長抑制作用在早期不及裸藥5-氟尿嘧啶,但隨著作用時間的延長,其抗腫瘤效果明顯增強并超過裸藥5-氟尿嘧啶,間接證明了5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒的藥物緩釋作用。
　　4.5-氟尿嘧啶經(jīng)殼聚糖包埋后能夠增加其對A2780細胞G1期的抑制作用,與此同時能抑制A2780細胞內PCNA蛋白表達,從而起到抑制A2780細胞增殖的作用。
　　5.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒能誘導