不同保存方法對純鈦表面理化性能以及生物活性的影響.pdf

1、背景:
　　 盡管人工種植牙應用于臨床已將近半個世紀，并且被廣泛證實具有可靠的臨床效果，但是仍然存在著以下問題:(1)種植體植入體內到臨床負重仍需要較長的愈合時間，最少需要6～12周的時間，這一定程度上限制了種植修復的臨床應用;(2)種植體與骨的結合率仍然較低，只有50～65％，不利于種植體的長期穩(wěn)定。加快種植體-骨結合的速度不僅僅意味著修復時間的縮短，更重要的是使人工牙種植具有更高的安全性。研究表明，大部分的種植失敗發(fā)生于種植

2、體早期愈合的過程中，愈合時間越長，種植體受到各種風險因素的影響越大，種植失敗的風險越高。因此，更快更好的骨結合仍然是我們追求的目標。
　　 大量的研究表明，種植體與骨組織形成結合的速度和強度與種植體表面的生物活性密切相關，而生物活性又與種植體表面的理化性能緊密相連。生物活性（bioactivity）是植入材料能夠與生物組織形成鍵合(Bone-bonding)的特性。即無論表面是否光滑，生物活性材料也能與生物組織產生直接的化學鍵性

3、結合。
　　 由于鈦及鈦合金的結構和性質與骨組織差異很大，加之表面鈍態(tài)氧化膜的存在。通常不能像生物活性材料那樣與骨組織發(fā)生化學鍵性結合。因此，一般認為鈦金屬為生物惰性材料，并努力尋求各種方法進行表面活化改性。鈦的生物活化是指使鈦金屬經過表面處理后，能夠在生理環(huán)境誘導下，使羥基磷灰石層在其表面形成，與骨組織實現(xiàn)直接的化學鍵結合。增加鈦表面的生物活性有以下兩種思路:(1)通過表面加成法在鈦表面涂覆生物活性涂層（如羥基磷灰石、鈣磷酸鹽

4、、生物大分子等）;(2)通過表面改性使原鈍化態(tài)氧化膜轉化為活化態(tài)氧化膜或其他活性膜（如鈦酸鹽，Ca+Ti，TiO2+Ca+P膜等）。目前，常用的一些表面處理技術包括噴砂酸蝕，微弧氧化，羥基磷灰石涂層等等。與光滑種植體表面相比，這些表面處理技術明顯改善了種植體的表面活性，促進了種植體-骨的結合。其中，紫外線光催化技術是近幾年的研究熱點之一。1997年，Wang等首先發(fā)現(xiàn)了紫外線照射TiO2膜上可以獲得高親水性表面的現(xiàn)象，并在Nature上

5、發(fā)表。此后，大量的學者對此進行了深入的研究。
　　 本課題組通過紫外線光催化技術處理純鈦表面，成功獲得了具有高表面能及高生物活性的表面，促進了蛋白質吸附、成骨細胞的黏附、增殖、分化和礦化。但進一步的研究結果表明，通過紫外線光催化技術獲得的高表面能及高生物活性效應具有一定的時效性。經過一段時間的保存后，這種效應逐漸消失，鈦片表面的生物活性明顯降低。另外，在經過其他表面處理方式制備的鈦表面上，也出現(xiàn)了鈦表面生物活性隨著保存時間的增加

6、而下降的情況，即鈦表面生物活性的老化現(xiàn)象(time-dependent degradation))。由此可見，鈦表面生物活性的老化是鈦基種植體普遍存在的現(xiàn)象。
　　 目前，導致鈦表面理化性能和生物活性隨時間下降的原因尚未明確。有研究認為，這可能與鈦表面在儲存的過程中受到空氣中碳氫化合物的污染，導致表面元素構成的改變及表面能下降有關。由于常規(guī)的種植體保存方式為常溫常壓保存于密封瓶里，可能會受到碳氫化合物的污染，因此，在儲存的過程中

7、鈦表面理化性能及生物活性可能已經發(fā)生變化，這值得我們深入研究。
　　 由于在實際應用中，臨床醫(yī)生不可能獲得新制備的鈦種植體，應用到臨床上的種植體均經過或長或短的保存時間，可能出現(xiàn)了不同程度的生物活性的下降，因此，如何保持種植體的表面活性已成為一個重要的研究課題。本研究首先從保存方法的角度出發(fā)，研究不同保存方法對鈦表面的理化性能及生物活性的影響，以盡可能保持鈦表面的生物活性，使應用到臨床上的種植體具有更佳骨結合效能。
　　

8、 目的:
　　 1.探討常規(guī)保存方法下，純鈦表面理化性能的時間性變化以及對生物活性影響。
　　 2.探討不同保存方法對純鈦表面理化性能及生物活性的影響，以及探討其可能的機制。
　　 方法:
　　 1.鈦片的制備及分組將商用二級純鈦(TA2)切割成直徑15mm，厚度1.5mm的鈦片后，通過H2SO4(49％)/HCl(18％)酸蝕法制備出具有一定的粗糙度，表面形態(tài)較為均勻，可重復性較高，表面清潔度良好的鈦表

9、面用于本實驗。
　　 第一部分實驗:探討常溫常壓保存方法下，純鈦表面理化性能的時間相關性變化及對表面活性的影響。分組:組1:新制備鈦片;組2:避光保存于密封盒內3天;組3:避光保存于密封盒內2周;組4:避光保存于密封盒內4周。制備完成的鈦片用于表面理化性能檢測、蛋白質吸附及細胞培養(yǎng)實驗。
　　 第二部分實驗:探討不同保存方法對純鈦表面理化性能及生物活性的影響。分組:組1:新制備鈦片，即制備完成后即刻用于表面理化性能檢測和

10、細胞培養(yǎng)。組2:避光保存于密閉盒里。組3～5:制備完成后即刻保存于雙蒸水(ddH2O)/氯化鈉(NaCl)/氯化鈣(CaCl2)溶液中。組2～5中的鈦片根據實驗設計，保存了3天，2周，4周不同時間，然后根據實驗設計對鈦片表面進行理化性能檢測、蛋白質吸附及細胞培養(yǎng)實驗。
　　 以上實驗均在清潔環(huán)境中完成。
　　 2.鈦片表面理化性能的檢測:
　　 通過掃描電鏡觀察、表面輪廓測量儀、X射線光電子能譜分析儀、水接觸角分

11、析儀等手段對不同處理組的鈦片表面進行表面形貌、表面粗糙度、表面元素、表面親水性進行檢測。以評估不同組別鈦片表面理化性能的差異。
　　 3.蛋白吸附實驗使用牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白，用于蛋白質吸附實驗。BCA法在波長為562 nm下測定OD值，根據標準曲線計算蛋白質吸附率（百分比）。
　　 4.細胞培養(yǎng)實驗選取MG63成骨細胞系用于本實驗，接種密度為2.4×104個/cm2。在不同的培養(yǎng)時間點，通過熒光染色劑染色

12、，熒光顯微鏡觀察，MTS試劑盒、ALP試劑盒、茜素紅染色等方法對細胞的黏附、增殖、分化以及礦化情況進行分析，以評估不同組別鈦片表面的細胞生物活性。
　　 統(tǒng)計分析
　　 采用Spss13.0統(tǒng)計軟件對各組間樣品的表面理化性能、蛋白質吸附、細胞黏附、細胞增殖和分化方面各項參數進行統(tǒng)計學分析。測定結果以(x)±s來表示，用析因設計分析處理組與不同時段是否存在交互效應，如存在交互效應，組間進一步采用單因素方差分析(one-wa

13、y ANOVA)，然后采用Levene's test檢查方差齊性，方差齊時對樣本均數進行兩兩比較的LSD檢驗，方差不齊時，采用近似F檢驗的Welch方法進行方差分析后，Dunnett'T3檢驗進行兩兩比較，假設檢驗為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義，當P＜0.01時，認為差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.掃描電鏡觀察結果:各組的鈦片均具有典型的酸蝕處理后的表面形態(tài)

14、，呈較均勻的多孔狀結構，孔徑為1～3μm。表面輪廓儀分析證實，所有的表面具有相似的粗糙度，各項參數沒有統(tǒng)計學差異。保存方式和保存時間對鈦片的表面形態(tài)沒有明顯的影響。
　　 2.X射線光電子能譜分析獲得的新制備的鈦片以及在其余4種不同方法中保存了3天，2周，4周不同時間的鈦片表面的高分辨能譜圖提示，所有樣品的表面均可發(fā)現(xiàn)Ti、O、C和微量的N，但不同組別的元素比例差異較大。新鈦片表面的碳元素含量最低，為26.0％。保存了3天后，在

15、常溫常壓、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液下保存的鈦表面C元素含量分別為36.3％、26.4％、26.7％、26.2％;保存了2周后，鈦表面C元素含量分別為42.9％、29.8％、28.8％、28.2％;保存了4周后，鈦表面C元素含量分別為48.2％、31.3％、30.7％、30.1％。不同組別間的Ti和O元素比例也體現(xiàn)出不同的變化。由此可見，在相同的保存時間點，保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的鈦片表面碳元素顯

16、著低于常溫常壓下保存。但是需要注意的是，所有的保存方法都不能完全避免C元素的污染。
　　 3.1μL ddH2O在各組不同鈦片表面的靜態(tài)水接觸角表明，新制備的鈦片表面表現(xiàn)出超親水性的特性，當ddH2O接觸到鈦片表面時，便迅速向四周鋪展，接近潤濕整個鈦片表面，靜態(tài)水接觸角為0°。當將鈦片常溫常壓下保存時，隨著保存時間的延長，鈦表面由親水性迅速向疏水性轉變。在保存3天后，靜態(tài)水接觸角為變?yōu)?9.70°;2周后，增加至90.27°;4

17、周后，變?yōu)?14.53°。而保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的鈦片表面，在保存3天及2周后，靜態(tài)水接觸角仍然為0°，即便在第4周時，仍保持了超級親水性（接觸角＜5°）的特性。
　　 2μL ddH2O在鈦片上的接觸面積表明，在常溫常壓保存方式下，ddH2O在鈦片上的接觸面積也隨著保存時間的延長而劇烈減少。但是要注意的是，在這三種保存方式下，ddH2O在鈦片表面的潤濕面積也隨著保存時間的延長而逐漸減小，但仍明顯優(yōu)于

18、常溫常壓下保存的鈦片表面。
　　 4.不同處理組鈦片表面1h的蛋白質吸附率結果提示:在常溫常壓保存方式下，鈦片表面蛋白質吸附能力隨著保存時間延長下降的程度比保存在ddH2O、NaCl溶液中的鈦片表面明顯，而保存在CaCl2溶液中的鈦片表面蛋白質吸附能力保持了穩(wěn)定性，未隨著保存時間的延長而明顯下降，在3天、2周及4周的保存時間里，保存在CaCl2溶液中的鈦片表面均表現(xiàn)出了最高的蛋白質吸附能力，在保存了3天鈦片表面，蛋白質吸附能力甚

19、至略高于新鈦片組。
　　 5.在細胞培養(yǎng)實驗中所選擇的30min、1h、2h及4h四個時間點中，所有處理組的鈦片表面的細胞黏附量均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。新制備的鈦片表面的細胞黏附效果非常好，細胞接種30 min后，約有40％的細胞成功黏附，而在接種4h后，大部分的細胞已經黏附到鈦片表面。在常溫常壓下保存了3天，2周及4周的鈦片表面，同一細胞培養(yǎng)時間點的細胞黏附率隨著保存時間的增加而顯著減少。在常溫常壓下保存了4周的鈦片表面，

20、細胞接種30min后，黏附率僅為新制備鈦表面的5％，即便經過4h的培養(yǎng)，也僅有50％接種細胞黏附到鈦片表面。通過比較保存在常溫常壓密封盒內、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面在30 min、1h、2h及4h細胞黏附情況，可以發(fā)現(xiàn)，保存在常溫常壓密封盒內細胞的黏附效果最差，顯著低于其它三種保存方法。所有的保存方法中，在CaCl2溶液中保存的鈦片表面在4個培養(yǎng)時間點均表現(xiàn)出最好的細胞黏附率，與新制備的鈦片表面無統(tǒng)計學差

21、異。
　　 6.細胞接種4h后，在熒光顯微鏡下觀察不同處理組鈦片表面細胞骨架的形態(tài)，可見新制備的鈦片表面大部分細胞伸展良好，細胞呈扁平狀，胞漿豐富，大量的偽足向四周伸出。在常溫常壓下保存了3天的鈦片表面上，僅見少部分伸展良好的細胞，其余大部分細胞胞體較小，呈圓形或橢圓形，未充分展開，在保存了2周和4周的鈦片表面上，幾乎所有的細胞胞體都呈圓形或橢圓形，未充分展開。在保存于ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面，細

22、胞形態(tài)與新制備鈦片表面上的細胞相近，大部分細胞伸展良好。
　　 7.在細胞培養(yǎng)第1天和第3天，在常溫常壓下保存了3天，2周及4周的鈦片表面，細胞的增殖活性均隨著保存時間的增加而減少。通過比較保存在常溫常壓密封盒內、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的鈦片表面的細胞增殖活性，可以得知，在細胞培養(yǎng)的第1天時，保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的鈦片表面細胞增殖活性與新制備的鈦片表面沒有統(tǒng)計學差異，并且顯著高

23、于常溫常壓保存的鈦片表面。在細胞培養(yǎng)的第3天時，保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的鈦片表面細胞增殖活性依然高于常溫常壓下保存的鈦片表面。其中，CaCl2組保存的鈦片表面細胞增殖活性最好，顯著高于保存在ddH2O及NaCl溶液中的鈦片表面(p＜0.05)，但與新制備的鈦片表面沒有統(tǒng)計學差異。
　　 8.堿性磷酸酶是細胞分化的早期標志。在細胞培養(yǎng)的第7天，對各組細胞培養(yǎng)樣本進行堿性磷酸酶活性的檢測。結果發(fā)現(xiàn)，各組細胞

24、的堿性磷酸酶活性沒有顯著的差異。鈦片的保存方法不會顯著影響細胞的堿性磷酸酶活性。
　　 細胞外基質礦化是通過茜素紅染色來檢測。實驗證明，鈦片表面細胞礦化能力受到保存方法的影響。常溫常壓保存的鈦片表面細胞外基質礦化能力最低，顯著低于其他組，而保存于CaCl2溶液中的鈦片表面以及新制備的鈦片表面的礦化能力最強。顯著高于其它組。
　　 結論:
　　 1.空氣中碳氫化合物的污染顯著影響純鈦表面的理化性能和生物學性能。