畜禽肉和活蝦中弧菌鑒定及第三代頭孢耐藥機(jī)制初探.pdf

1、畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展在為人類提供足夠的畜禽和水產(chǎn)品的同時(shí)，也通過食物鏈提高了動(dòng)物源耐藥致病菌引起的人類健康風(fēng)險(xiǎn)，目前致病性弧菌對(duì)人類的威脅越來越嚴(yán)重。本文就圍繞畜禽和水產(chǎn)品中致病性弧菌分離鑒定，及這些弧菌的耐藥性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)部分:
　　一、畜禽肉和活蝦中弧菌的分離鑒定及毒力基因檢測(cè)
　　本試驗(yàn)旨在分離鑒定深圳市畜禽和水產(chǎn)品（牛、豬、雞、蝦）中的主要弧菌，并檢測(cè)其毒力因子、毒力相關(guān)基因分布特征，為控制畜牧生產(chǎn)中致

2、病弧菌的產(chǎn)生和傳播提供理論依據(jù)。試驗(yàn)于不同時(shí)間、相同地點(diǎn)采集深圳某區(qū)畜禽肉和活蝦樣品進(jìn)行弧菌的分離，采用多重PCR和測(cè)序方法鑒定疑似孤菌，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)副溶血性弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因。結(jié)果表明，蝦肉樣品中弧菌的檢出率為65.22％，畜禽肉樣品中弧菌的檢出率為12.38％,總體檢出率為25.45％;共鑒定獲得100株副溶血性弧菌、23株溶藻弧菌和1株創(chuàng)傷弧菌。100株副溶血性弧菌中只檢測(cè)到2株存在trh基因，均未檢測(cè)到tdh基

3、因;23株溶藻弧菌中，檢測(cè)到了FlaA、ompW、 fur、collagenase、toxS、UreR基因，未檢測(cè)到tdh、trh、toxR基因;而1株創(chuàng)傷弧菌中未發(fā)現(xiàn)任何毒力因子。以上結(jié)果表明，深圳某區(qū)畜禽肉和活蝦中存在一定數(shù)量的致病性弧菌，溶藻弧菌中致病因子既復(fù)雜又獨(dú)特，需加強(qiáng)畜禽及蝦等水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中的衛(wèi)生防疫，以控制其肉制品中致病弧菌的攜帶和對(duì)人類健康的安全隱患。
　　二、弧菌的耐藥性分析及ESBLs檢測(cè)
　　本試

4、驗(yàn)旨在了解畜禽冷鮮肉和活蝦中弧菌的耐藥情況，并檢測(cè)超廣譜性β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)耐藥基因在弧菌中的流行情況，為指導(dǎo)畜牧生產(chǎn)中β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的合理使用，減少其耐藥程度和控制其耐藥性的傳播擴(kuò)散提供一定的理論依據(jù)。采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法檢測(cè)弧菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)所有弧菌對(duì)四環(huán)素、阿米卡星、美羅培南都敏感，但對(duì)氨芐西林、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑

5、、頭孢曲松、頭孢噻肟、萘啶酸、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、氧氟沙星有不同程度的耐藥;其中13株副溶血性弧菌、6株溶藻弧菌、1株創(chuàng)傷弧菌對(duì)第三代頭孢耐藥。在副溶血性和溶藻弧菌中均發(fā)現(xiàn)blaper-1、blacmy-2和blaveb-1這3種ESBLs耐藥基因，而在創(chuàng)傷弧菌中僅發(fā)現(xiàn)blaper-1基因。綜上所述，分離自畜禽肉和活蝦中的弧菌具有不同程度的多種抗生素耐藥性，并攜帶多種ESBLs耐藥基因。
　　三、弧菌的PFGE

6、分型及質(zhì)粒溯源分析
　　細(xì)菌可通過質(zhì)粒對(duì)耐藥性基因進(jìn)行水平傳播，本試驗(yàn)旨在通過接合和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)說明質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs（超廣譜β-內(nèi)酰胺酶）耐藥基因的傳播性，通過PFGE來分析攜帶ESBLs基因弧菌的同源性，及對(duì)部分菌株質(zhì)粒序列的研究來探討質(zhì)粒溯源。結(jié)果表明，共16株弧菌接合成功，1株弧菌轉(zhuǎn)化成功，其接合和轉(zhuǎn)化的成功率在84％。在NotⅠ酶切后進(jìn)行PFGE，11株副溶血性弧菌成功跑出條帶，其菌株條帶數(shù)在9-19之間，彼此之間相似度都

7、低于80％;6株溶藻弧菌跑出的條帶數(shù)在19-23之間，彼此之間相似度都低于74％;同時(shí)，通過S1酶切原菌及對(duì)應(yīng)的結(jié)合子或轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行PFGE，得到質(zhì)粒的數(shù)量和大小，然后通過southern雜交試驗(yàn)驗(yàn)證，確定不同質(zhì)粒攜帶ESBLs基因情況。在成功跑出S1-PFGE及雜交成功的結(jié)果中顯示:一株來自豬肉樣品的副溶血性弧菌VBT1中存在一個(gè)大小在120KB且攜帶blacmy-2基因的質(zhì)粒;一株來自蝦樣品的溶藻孤菌VBT24中存在一個(gè)大小在210