小白菊內脂對人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細胞的體外作用及其機制的研究.pdf

1、目的:近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率和病死率也在呈上升趨勢。該病的早期可手術治療。因為腫瘤的發(fā)展依賴于雄激素的存在，對于錯失手術時機多數(shù)患者可行雄激素阻斷治療，但隨著治療時間的延長，腫瘤往往轉變?yōu)榧に氐挚剐颓傲邢侔?hormone-refractoryprostatecancer,HRPC)。因此繼續(xù)開發(fā)一種能有效地控制腫瘤生長，改善患者癥狀的藥物具有重要的意義。小白菊內酯(panhenolide，PTL)是從中草藥艾菊中提取的，屬于倍半

2、萜稀內酯類化合物，在一些西方國家，早年間已被提純并用于消炎鎮(zhèn)痛之用。一般被用于治療關節(jié)炎、頭痛、偏頭痛及感冒發(fā)熱等，隨著國內外學者對小白菊的深入研究，現(xiàn)已證實小白菊內酯在體內外對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制效果，如乳腺癌、胃癌及肝癌等多種腫瘤。近幾年國外一些研究表明PTL可能對前列腺癌有一定作用，但研究較少，且浮于表面，具體作用大小及機制尚不清楚，因此本實驗通過觀察PTL對體外培養(yǎng)的人雄激素非依賴性前列腺癌DU-145細胞的增殖、凋亡的影

3、響并探討其作用機制，旨在為前列腺癌的輔助治療及PTL的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 體外細胞傳代培養(yǎng)人前列腺癌DU-145細胞。待細胞對數(shù)生長期，大約生長至70％時，進行藥物刺激。實驗組細胞給予不同濃度的PTL處理，對照組細胞給予生理鹽水處理。
　　 2.細胞增殖分析
　　 分別應用MTT法和及細胞計數(shù)法對細胞增殖分析。以測定檢測各濃度、時間點細胞的吸光度OD值，

4、推算抑制率，評估PTL是否影響DU-145細胞增殖。
　　 3.流式細胞學分析
　　 取敏感濃度，以濃度梯度分組處理各組細胞后，消化制備成單細胞懸液，然后經(jīng)過經(jīng)固定、洗滌及染色等過程后，用流式細胞學分析PTL對DU-145細胞周期分布和凋亡的影響。
　　 4.免疫細胞化學染色
　　 將細胞接種于玻片上，用PTL處理48h后，取出玻片將各組細胞固定。用TritonX-100處理玻片，封閉后一抗及二抗結合反應

5、，然后通過DAB顯色后光鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算其所占比例，檢測KI67蛋白表達率。
　　 5.Western印跡分析
　　 取等量細胞總蛋白，加樣與SDS聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過電泳、電轉膜，封閉、一抗及二抗結合、化學發(fā)光等過程，然后對Cleaved-caspase3、Bcl-2和Bax蛋白進行檢測。
　　 結果:
　　 1.PTL抑制DU-145細胞增殖
　　 MTT和細胞計數(shù)分析顯示，PTL可以明

6、顯抑制DU-145細胞增殖，具有明顯的時間和濃度依賴性，呈明顯的正相關性(P＜0.05)。免疫細胞化學染色結果表明，PTL處理DU-145細胞后增殖標志物KI67蛋白表達降低，與濃度呈負相關性(P＜0.05)。
　　 2.PTL促進DU-145細胞凋亡
　　 流式細胞學結果表明，PTL促進DU-145細胞阻滯于G0/G1期(P＜0.01)，并誘導DU-145細胞出現(xiàn)明顯的凋亡峰(P＜0.05)。Western印跡結果表明

7、PTL處理DU-145細胞后增殖凋亡標志物Cleaved-caspase3表達增加，與濃度呈正相關性(P＜0.01)。Western印跡結果表明在PTL處理DU-145細胞后促凋亡蛋白Bax表達水平明顯升高，與濃度呈正相關性(P＜0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯降低，與濃度呈負相關性(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.小白菊內酯可明顯抑制人前列腺癌DU-145細胞的增值，且呈明顯的時間、劑量依賴性

8、，可能與下調KI67蛋白表達有關。
　　 2.小白菊內酯對人前列腺癌DU-145細胞的細胞周期有一定影響。隨著藥物濃度的增小大，DU-145細胞G0/G1期細胞數(shù)明顯增多，S和G2/M期細胞數(shù)減少，細胞周期阻滯于G0/G1期。
　　 3.小白菊內酯可以有效誘導人前列腺癌DU-145細胞凋亡，呈時間、劑量依賴性。凋亡可能與上調人前列腺癌DU-145細胞中Cleaved-caspase3的表達有關。
　　 4.上調B