慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi靶向沉默HSP70基因?qū)α馨土黾毎蛲龅挠绊?pdf

1、本文分析了慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi靶向沉默HSP70基因?qū)α馨土黾毎蛲龅挠绊?。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白對淋巴瘤細胞株轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化研究。
　　 目的：觀察淋巴瘤細胞株中慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)移的效率，通過觀察不同轉(zhuǎn)染條件下慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率實現(xiàn)對其轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，為進一步研究慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾在淋巴瘤細胞中的應(yīng)用提供基本條件。
　　

2、方法：首先設(shè)計并合成帶綠色熒光蛋白的慢病毒載體顆粒，按細胞株（人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji、人彌漫大B淋巴瘤細胞株Ly8和人套細胞淋巴瘤細胞株Sp53)、感染復(fù)數(shù)（MOI=1、10、30、50、60及100）、促轉(zhuǎn)染試劑(Polybrene和Enhanced Infection Solution)、轉(zhuǎn)染條件（離心和不離心）分組進行轉(zhuǎn)染，然后在不同的時間點熒光顯微鏡下觀察淋巴瘤細胞的綠色熒光蛋白表達情況，通過計算綠色熒光蛋白表達的

3、細胞比率，明確各轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率,對人彌漫大B淋巴瘤細胞株Ly8進行轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)，4周后流式細胞儀分析攜帶綠色熒光蛋白細胞的比率。
　　 結(jié)果：⑴細胞株，感染復(fù)數(shù)，促轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染條件均對細胞的轉(zhuǎn)染效率有影響，Sp53細胞株的轉(zhuǎn)染效率大于Ly8細胞株，它們的轉(zhuǎn)染效率均大于Raji細胞株；感染復(fù)數(shù)越大，細胞轉(zhuǎn)染效率越高，當達到一定極限后，轉(zhuǎn)染效率不隨感染復(fù)數(shù)的增加而增加；Polybrene的促轉(zhuǎn)染效果大于Enhanced I

4、nfection Solution;對懸浮細胞來說，離心的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于不離心的轉(zhuǎn)染效率，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在人套細胞淋巴瘤細胞株Sp53中，感染復(fù)數(shù)為60，使用Polybrene為促轉(zhuǎn)染試劑時，轉(zhuǎn)染效率最高可達90％。⑵慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染入淋巴瘤細胞株后可穩(wěn)定傳代4周，4周后其轉(zhuǎn)染效率仍可達85.6％。
　　 結(jié)論：①慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白對淋巴瘤細胞的轉(zhuǎn)染效率在人套細胞淋巴瘤細胞株Sp5

5、3中，感染復(fù)數(shù)為60，使用Polybrene為促轉(zhuǎn)染試劑時，轉(zhuǎn)染效率最高可達90％。②慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白對淋巴瘤細胞株的轉(zhuǎn)染可穩(wěn)定的傳代。
　　 第二部分：RNA干擾靶向沉默HSP70基因?qū)μ准毎馨土黾毎蛲龅挠绊憽?br>　　 目的：觀察靶向沉默HSP70基因?qū)μ准毎馨土黾毎闟p53細胞生物學(xué)特性的影響，探討HSP70基因?qū)μ准毎馨土龅蛲鐾緩降挠绊懀瑸樘准毎馨土龅闹委熖峁┬碌乃悸贰?br>　　 方法：首

6、先設(shè)計并構(gòu)建針對HSP70基因的慢病毒干擾載體，然后按論文一所得出的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件對套細胞淋巴瘤細胞株Sp53進行轉(zhuǎn)染，采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后Sp53細胞中HSP70蛋白表達的變化。采用Annexin-V-PE熒光染料檢測靶向干擾HSP70基因?qū)μ准毎馨土黾毎闟p53凋亡的影響。
　　 結(jié)果：⑴HSP70慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)染套細胞淋巴瘤細胞株Sp53后240小時，收集細胞進行Western blot，結(jié)果表明

7、，與空白Sp53組和陰性對照Sp53組相比，轉(zhuǎn)染HSP70慢病毒顆粒的細胞HSP70的表達顯著降低(P＜0.05)。這表明，設(shè)計合成針對HSP70的慢病毒載體顆粒可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HSP70基因的表達。⑵慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染Sp53細胞后240小時，用PE標記的Annexin-V-抗特異性結(jié)合凋亡細胞，熒光顯微鏡下觀察PE陽性細胞比率，即得到細胞凋亡率。結(jié)果表明，與空白Sp53組和陰性對照Sp53組相比，轉(zhuǎn)染HSP70慢病毒顆粒的細胞的凋亡