矽塵暴露人群血清生物標(biāo)志物的篩選及其相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、矽肺(silicosis)是由于長(zhǎng)期吸入大量游離二氧化硅(siO2)粉塵引起的以肺間質(zhì)纖維化為主的全身性疾病,在我國(guó)是危害最嚴(yán)重的職業(yè)病之一。在我國(guó)平均每例塵肺病人每年經(jīng)濟(jì)損失約為3.41萬(wàn)元,每年僅因塵肺病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)140多億元,每年新增塵肺病例造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)6億元。近年來(lái)矽肺病的流行呈現(xiàn)出群發(fā)性、低齡化以及致殘率高的新特點(diǎn),這給矽肺的防治工作帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)矽肺的診斷有價(jià)值的血清生物標(biāo)志物,如肺特異性的克

2、拉拉細(xì)胞蛋白(cc16)、肺表面活性物質(zhì)D(SP-D)作為診斷指標(biāo)仍存在敏感性、特異性不足的缺點(diǎn),不同類(lèi)型的肺間質(zhì)病之間這些指標(biāo)重疊較大；而支氣管肺泡灌洗液的化學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢查僅能作為影像學(xué)診斷的補(bǔ)充。運(yùn)用新技術(shù)手段篩選高特異性、敏感性的標(biāo)志物將對(duì)矽肺的早期防治起到重要的推動(dòng)。液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是一種基于磁珠分選與基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)聯(lián)合應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),可直接檢測(cè)臨床未經(jīng)特殊處理的血清

3、、尿液、腦脊液或漿膜腔積液等標(biāo)本,對(duì)疾病(特別是腫瘤)的診斷有較高的敏感性和特異性。本研究采用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)矽塵暴露人群血清蛋白的表達(dá),篩選出矽肺發(fā)病早期的生物標(biāo)志物建立矽肺早期診斷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型并對(duì)鑒定出的標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)功能的初步研究。
　　 研究目的：
　　 應(yīng)用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選矽塵暴露人群早期診斷血清生物標(biāo)志物,并對(duì)鑒定出的生物標(biāo)志物進(jìn)行初步功能研究。
　　 研究方法：

4、r>　　 矽塵暴露人群85例為山西省陽(yáng)泉市某耐火材料廠接觸游離二氧化硅粉塵的工人,統(tǒng)一攝高千伏X射線后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s),由具有診斷資格的診斷專(zhuān)家組按照《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ70-2002》進(jìn)行診斷,分為矽塵暴露組(無(wú)塵肺0期)、可疑矽肺組(無(wú)塵肺0+期)和Ⅰ期矽肺組；30例非暴露正常對(duì)照組為某單位年度體檢人員,均無(wú)矽塵暴露史。
　　 本研究首先應(yīng)用invitrogen公司生產(chǎn)的D

5、ynabeads RPC18磁珠,對(duì)矽塵暴露人群和非暴露正常對(duì)照組的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)(多肽)的分選,然后對(duì)分選后的蛋白(多肽)采用MALDI-TOF-MS的一級(jí)質(zhì)譜技術(shù)和ClinProTools分析軟件進(jìn)行差異蛋白峰的篩選,同時(shí)應(yīng)用Matlab分析軟件建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型,最后對(duì)篩選出的差異蛋白質(zhì)峰采用MALDI-TOF-MS二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸序列鑒定。
　　 按照二級(jí)質(zhì)譜鑒定出來(lái)的氨基酸序列人工合成差異蛋白,并用不同濃度

6、的蛋白溶液作為刺激物,觀察其對(duì)矽肺形成過(guò)程中的靶細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.一級(jí)質(zhì)譜尋找差異顯著峰結(jié)果:利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(SNN)建立模型進(jìn)行各組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)0期與0+期、0期與Ⅰ期、0+期與Ⅰ期比較,其識(shí)別率分別為64.35％、84.38％和73.49％,其交叉驗(yàn)證能力分別為63.14％、52.82％和69.07％；而正常對(duì)照組(control)與0期、正常對(duì)照組與0+期

7、、正常對(duì)照組與Ⅰ期比較,其識(shí)別率分別為89.23％、98.52％和98.96％交叉驗(yàn)證能力分別為87.66％、94.20％和85.53％。
　　 由上可知,0期與0+期、0期與Ⅰ期、0+期與Ⅰ期比較,其識(shí)別率和交叉驗(yàn)證能力都較差；而正常對(duì)照組(control)與0期、正常對(duì)照組與0+期、正常對(duì)照組與Ⅰ期比較,其識(shí)別率和交叉驗(yàn)證能力都較好。因此,僅對(duì)0期、0+期、Ⅰ期與正常對(duì)照組的差異顯著峰進(jìn)行提取,共得到5個(gè)差異峰(P<0.01

8、),其中5081Da和5066Da為表達(dá)上調(diào)的蛋白峰,2021da、3954da和1777da為表達(dá)下調(diào)的蛋白峰。
　　 2.二級(jí)質(zhì)譜鑒定差異顯著峰氨基酸序列結(jié)果:根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜儀器要求,選擇分子量<3KDa的峰2021Da和1777Da進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列結(jié)果兩蛋白質(zhì)峰同為補(bǔ)體C3的一個(gè)片段C3f。
　　 3.矽塵暴露人群接塵量與差異峰強(qiáng)度相關(guān)性分析:接塵量與5081Da、5066Da、3954Da、2021Da

9、和1777Da5個(gè)差異顯著峰的峰強(qiáng)的相關(guān)系數(shù)依次為r5081=0.039(P=0.614)、r5066=0.104(P=0.180)、r3954=-0.047(P=0.543)、r2021=-0.028(P=-0.714)、r1777=-0.016(P=0.853),5個(gè)差異蛋白峰強(qiáng)度與接塵量均不存在相關(guān)性。
　　 4.矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的建立:篩選出峰效果較好的2021Da、2554Da.、5066Da、8600

10、Da.4個(gè)P(0.001的共同差異蛋白質(zhì)峰建立矽塵暴露人群診斷模型,其區(qū)分矽塵暴露人群與正常對(duì)照組的特異性為100％,敏感性為90％,準(zhǔn)確率為92.3％；該模型診斷O期、0+期和Ⅰ期的識(shí)別率分別為100％、93％和96％。
　　 5.不同濃度C3f刺激對(duì)MRC-5細(xì)胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1的表達(dá)量均呈進(jìn)行性降低。與對(duì)照組相比,各濃度點(diǎn)均有顯著差異(P<

11、0.05)。
　　 6.不同濃度C3f刺激對(duì)MRO-5胞質(zhì)中TGF-β1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,MRC-5胞質(zhì)中TGF-β1的積分光密度值呈進(jìn)行性降低,各濃度點(diǎn)均有顯著差異(P<0.05)
　　 研究結(jié)論：
　　 1.運(yùn)用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的一級(jí)質(zhì)譜尋找矽塵暴露人群差異蛋白,并成功建立了矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型。
　　 2.運(yùn)用液體飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出1777