骨髓間充質(zhì)干細胞移植在輸尿管不全梗阻大鼠腎臟中的分化.pdf

1、目的:
　　 梗阻性腎病(obstructive nephropathy,ON)是泌尿外科常見疾病,以腎小管間質(zhì)纖維化為主要病理特點。兒童梗阻性腎病最終可導致終末期腎臟疾病(end-stage renal disease ESRD),梗阻性腎病占所有ESRD的0.3％,占所有兒童腎移植的16.1％。在人類梗阻性腎病中,多數(shù)為不全性梗阻。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有自我增殖和多向分化潛能的特點,可向中胚層、內(nèi)胚

2、層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化,包括成骨細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞和腎臟細胞等,有研究表明骨髓MSCs在急性腎臟損傷小鼠模型中可以促進腎臟結(jié)構(gòu)修復、改善腎功能。肝細胞生長因子(HGF)是促進成體干細胞向腎臟細胞分化的候選因子,還具有阻止腎小管細胞發(fā)生凋亡的能力。
　　 本實驗通過體外分離、培養(yǎng)、純化和擴增大鼠骨髓MSCs,并建立單側(cè)輸尿管不全梗阻(partial unilateral ureter obstruction PUU

3、O)大鼠動物模型,將Ad-HGF和MSCs共同移植入解除梗阻的PUUO大鼠體內(nèi),觀察MSCs是否能夠遷移、分布、定居到腎臟,并分化為相應的腎臟細胞,以及.Ad-HGF對MSCs的影響,為梗阻性腎病的基因治療及細胞替代治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法:
　　 MSCs細胞培養(yǎng)與純化:體外分離、培養(yǎng)雄性SD大鼠MSCs,流式細胞儀進行CD34、CD90表型鑒定;以不同強度攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-GFP)

4、轉(zhuǎn)染MSCs,用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率,篩選出最佳轉(zhuǎn)染強度(MOI),并以最佳轉(zhuǎn)染強度將Ad-GFP基因體外轉(zhuǎn)染MSCs。
　　 PUUO大鼠模型制作:成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)(30只),按照對左腎輸尿管上段處置方式不同隨機分成5組,正常對照組(6只);腰大肌包埋組(6只);套管壓迫組(6只);絲線結(jié)扎組(6只);浸液體石蠟油的絲線結(jié)扎組(6只)。分別于梗阻后3d、1W、2W各取2只,大體觀察同時行IVP檢查,確

5、定輸尿管梗阻情況。
　　 MSCs細胞的轉(zhuǎn)染及分化:選擇成年健康雌性SD大鼠(260g±20g)32只,制作PUUO大鼠動物模型,隨機分為對照組(A)和實驗(B、C)。PUUO術(shù)后7天解除梗阻,并同時在解除梗阻側(cè)腎臟實質(zhì)多點注射,A組單純注射生理鹽水:B組注射綠色熒光蛋白標記的MSCs:C組注射MSCs與Ad-HGF的混合物。于注射術(shù)后7天、14天分別處死移植組及對照組大鼠,取雙側(cè)腎臟,制作石蠟切片,利用免疫熒光雙標方法檢測MS

6、Cs在PUUO大鼠腎臟中的分布及分化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、骨髓MSCs原代培養(yǎng)7-9天可傳代,傳代后細胞增殖加快,4-5天可再次傳代;流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示骨髓MSCs中CD90陽性細胞占99％,不表達CD34。
　　 2、轉(zhuǎn)染強度MOI=400時,轉(zhuǎn)染效率可達85.91％。
　　 3、浸石蠟油的絲線結(jié)扎組模型用彈簧秤控制力度(0.25kg),使模型的均一性得到控制;用IVP檢查確定模型組為輸尿

7、管不完全梗阻。
　　 4、免疫熒光雙標結(jié)果表明:在PUUO大鼠解除輸尿管梗阻術(shù)后7天、14天梗阻側(cè)腎臟均可見Ad-GFP陽性細胞,Ad-HGF和MSCs共同移植組與單純MSCs移植組相比,Ad-GFP陽性細胞百分率明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、貼壁細胞分離法可以分離、純化大鼠MSCs。
　　 2、彈簧秤控制結(jié)扎力度(0.25 kg)下,浸石蠟油的絲線輸尿管結(jié)扎法是一種理想的PUUO