CacyBP-SIP核轉位在結腸癌中的意義.pdf

1、CacyBP是1998年發(fā)現(xiàn)的以鈣依賴的方式結合CalCyclin的蛋白；2001在研究P53刺激下β-catenin泛素化降解新通路時發(fā)現(xiàn)，SIP通過與泛肽連接酶結合，參與P53刺激下β-catenin的降解。進一步的研究發(fā)現(xiàn)：SIP即CacyBP,因此目前命名為CacyBP/SIP。 CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白，S100家族是Ca2＋結合蛋白家族中最大的亞類，以組織特異性的方式作為鈣信號的傳導器，與特異的靶蛋

2、白相互作用，介導鈣信號對細胞的調控?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可與S100A1、A6、A12、B、P結合，它們均與腫瘤的進展/轉移有關。近有研究表明CacyBP/SIP與細胞分化、發(fā)育有關。在研究小鼠受孕子宮發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，CacyBP/SIP的表達逐漸升高，第7天時達高峰，其表達受雌、孕激素的調節(jié)，表明它與受孕子宮內膜細胞的發(fā)育有關；心肌肥大時CacyBP/SIP表達上調，隨后的研究發(fā)現(xiàn)它可促進H9C2細胞及小鼠心肌的分化

3、及DNA合成。 已有兩家研究機構報道，在神經細胞內CacyBP/SIP具有依賴于Ca2＋濃度的核轉位及磷酸化現(xiàn)象。Ca2＋是細胞內最重要的第二信使，通過其濃度的變化來傳遞信息。在神經細胞內Ca2＋濃度升高，CacyBP/SIP轉位至細胞核，同時發(fā)生磷酸化；細胞內Ca2＋濃度降低時，CacyBP/SIP轉位至細胞漿，同時發(fā)生去磷酸化。蛋白轉位至細胞核且發(fā)生磷酸化對于傳遞細胞外信號，調控下游基因表達具有重要意義。但這種現(xiàn)象究竟有何意

4、義呢？本課題將對此進行探討。 目的: 1、CacyBP/SIP單克隆抗體的制備；2、CacyBP/SIP在正常組織和腫瘤組織中的表達分布；3、CacyBP/SIP在結腸癌組織中的表達及功能；4、CacyBP/SIP核轉位影響結腸癌細胞功能的可能機制。 方法: 1、應用淋巴細胞雜瘤技術制備小鼠源性抗人CacyBP/SIP Mab，采用Western Blot及ELISA等方法鑒定抗體的特異性和敏感性；2、應

5、用正辛酸-飽和硫酸銨方法純化抗體，通過SP免疫組織化學技術，觀察CacyBP/SIP在正常組織和腫瘤組織中的分布；3、利用免疫組化、Western Blot觀察CacyBP/SIP在結腸癌、癌旁組織、結腸癌細胞中的表達和細胞定位；4、通過基因重組方法構建CacyBP/SIP的siRNA載體、全長載體、C端截短體；5、間接免疫熒光細胞內染色、Western Blot檢測CacyBP/SIP在胃泌素誘導下在結腸癌細胞中的定位；6、利用細胞M

6、TT實驗、平皿克隆形成試驗、細胞周期檢測等研究CacyBP/SIP入核對結腸癌細胞SW480和HT29增殖的影響；7、通過Western Blot、激酶實驗、co-IP觀察CacyBP/SIP入核后細胞周期蛋白及活性的變化；8、應用蛋白酶抑制劑通過抑制泛素-蛋白酶體通路探討細胞周期蛋白改變的機制；9、利用激光共聚焦觀察C端截短體在細胞內定位；10、利用Western Blot、co-IP觀察CacyBP/SIP截短體轉染細胞后細胞周期蛋

7、白表達變化。 結果: 1、制備了CacyBP/SIP 單克隆抗體獲得3 株抗CacyBP/SIP 的單克隆抗體，其亞型均為IgG(κ)亞類，間接ELISA測定腹水效價達1 ×10-7，Western Blot及ELISA表明三株Mab具有較高的特異性與敏感性，均能識別組織及細胞內天然及變性CacyBP/SIP蛋白。 2、CacyBP/SIP 在正常及腫瘤組織中的分布以獲得單抗為工具，較系統(tǒng)研究CacyBP/S

8、IP 在正常組織及腫瘤組織中的表達。通過IHC 染色發(fā)現(xiàn)：心臟、腦中CacyBP/SIP 呈強染色，主要表達于心肌細胞、神經元及神經膠質細胞；在胃、結腸、肝等弱表達或表達缺失。在大多數(shù)腺上皮起源的腫瘤中，CacyBP/SIP 均著色，包括胃癌、結腸癌、直腸癌等，其中在胰腺癌中顯示出較強的著色，在鼻咽癌中著色最強。CacyBP/SIP 亦可在鱗狀上皮起源的腫瘤中著色，如肺鱗癌及食道鱗癌。我們還發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP 在其它細胞來源的腫瘤

9、中著色：如膀胱/輸尿管移行細胞癌，神經膠質瘤，骨肉瘤。在肝癌、黑色素瘤及卵巢癌中著色罕見或缺失。CacyBP/SIP 在多數(shù)正常組織不表達或弱表達，而在多數(shù)腫瘤組織中表達或表達增強，這一結果提示CacyBP/SIP 可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起作用。 3、CacyBP/SIP 在結腸癌中高表達我們利用免疫組化技術檢測了CacyBP/SIP 在10 例正常結腸粘膜，50 例結腸癌及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP 主要定位于

10、結腸癌細胞的胞漿和胞核，在正常結腸粘膜表達缺失，結腸癌表達陽性率（51％），明顯高于癌旁組織（26％，p<0.05）。Western Blot 顯示CacyBP/SIP 在結腸癌中的表達明顯高于相應癌旁組織（p<0.05）。對3 種結腸癌細胞系中CacyBP/SIP 表達顯示，HT29 及SW480 細胞中均表達CacyBP/SIP。以上研究結果說明CacyBP/SIP 在結腸癌中高表達，可能在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。 4、

11、胃泌素可誘導CacyBP/SIP 轉位至細胞核胃泌素作為內分泌激素，除具有促進胃酸分泌的功能，還是體內重要的生長因子，研究已證實它可促進正常結腸粘膜及結腸癌的增殖，與受體結合后可升高細胞內鈣離子；而CacyBP/SIP 具有依賴鈣離子濃度的核轉位。那么，胃泌素可否誘導CacyBP/SIP 核轉位呢？我們給予胃泌素刺激后，間接免疫熒光、Western Blot 顯示CacyBP/SIP 轉位至細胞核。我們進而構建了CacyBP/SIP的兩

12、個siRNA 載體，穩(wěn)定轉染了結腸癌SW480 和HT29 細胞，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIPsi1 載體能顯著抑制結腸癌細胞中CacyBP/SIP 的表達，命名為SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi，此細胞在胃泌素刺激后，間接免疫熒光、Western Blot 顯示CacyBP/SIP 無轉位現(xiàn)象發(fā)生。我們通過給予胃泌素誘導CacyBP/SIP 核轉位，建立了研究CacyBP/SIP 入核功能的細胞模

13、型；通過抑制CacyBP/SIP 的表達，建立了研究CacyBP/SIP 入核受抑的細胞模型。 5、CacyBP/SIP 入核可促進結腸癌增殖我們采用MTT 法、平皿克隆形成試驗探討胃泌素誘導CacyBP/SIP 核轉位后對結腸癌細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)：與未加胃泌素的對照細胞相比，給予胃泌素后促細胞增殖的作用增強(P<0.05)，促細胞集落形成明顯增加(P<0.05)；細胞周期結果表明：與未刺激組相比，給予胃泌素后，SW48

14、0 與HT29細胞的G1 期明顯縮短。在SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi 中，CacyBP/SIP 入核受抑，MTT、平皿克隆形成試驗表明：與未加胃泌素的對照細胞相比，給予胃泌素后細胞增殖的差別無顯著性差異(P>0.05)，促細胞集落形成的能力無明顯差異(P>0.05)。細胞周期結果表明：與未刺激組相比，給予胃泌素后，SW480-CacyBP/SIPsi 及HT29-CacyBP/SIPsi 細

15、胞的G1 期無明顯變化。以上研究提示CacyBP/SIP 核轉位可促進結腸癌增殖，這種增殖作用可能通過促進細胞周期進展而實現(xiàn)的。 6、CacyBP/SIP通過增強泛素介導的P27kip1降解促結腸癌增殖為進一步明確CacyBP/SIP核轉位后促進細胞周期進展的分子機制，我們首先應用Western Blot檢測G1期進展中關鍵細胞周期蛋白的表達。應用同步化藥物nocodazole處理結腸癌細胞SW480及HT29，結果表明：胃泌

16、素刺激后，P27kip1表達降低，Cyclin E蛋白表達升高。抑制CacyBP/SIP核轉位后P27kip1與Cyclin E的表達無變化。Cdk2激酶活性檢測明顯升高，同時細胞中P27kip1結合Cdk2的量減少。以此結果提示CaycBP/SIP入核后P27kip1蛋白量減少，Cdk2激酶活性增加，導致G1期進展。給予蛋白酶體抑制劑MG132抑制26S蛋白酶體的活性，結果發(fā)現(xiàn)：MG132處理細胞后，P27kip1、Cyclin E表

17、達無明顯變化，說明P27kip1降解的增強是通過26S蛋白酶通路。P27kip1是SCF泛素酶的靶蛋白，研究已發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP通過其C未端與Skp1結合，我們應用CacyBP/SIP免疫共沉淀亦證實：在結腸癌細胞HT29及SW480中，CacyBP/SIP可以與Skp1結合。我們進而構建了CacyBP/SIP的截短體，CacyBP/SIP (Δ73–228)，缺失了C末端結構域，并克隆入Pegfp/C1表達融合綠色熒光蛋白的質粒

18、Pegfp/C1- CacyBP/SIP(Δ73–228)。轉染SW480-CacyBP/SIPsi細胞，激光共聚焦觀察C端截短體在胃泌素刺激后亦可入核。免疫共沉淀證實，該截短體不能與Skp1結合，與此同時，P27kip1的表達則無明顯變化。這一結果說明CacyBP/SIP通過與Skp1結合，增強了泛素-26S蛋白酶體復合物對P27kip1的降解。 結論: 本研究發(fā)現(xiàn)胃泌素誘導CacyBP/SIP入核后通過增強泛素介導