花色苷對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、本次研究擬在前期對(duì)花色苷生物學(xué)作用研究的基礎(chǔ)上，采用大鼠成熟原代脂肪細(xì)胞為模型，選用花色苷中常見的矢車菊素-3-葡萄糖苷作為受試物，觀察花色苷在體外對(duì)大鼠原代脂肪細(xì)胞AMPK活化、脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響，以及在體內(nèi)對(duì)AMPK以及其下游酶類活化的影響，明確花色苷是否能夠通過AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪積聚。
　　 研究目的：
　　 1觀察花色苷在體外對(duì)原代脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響，探討AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)

2、脂肪積聚的機(jī)制；
　　 2觀察花色苷在體內(nèi)對(duì)脂肪細(xì)胞的作用，探討與AMPK通路的相關(guān)機(jī)制，以及花色苷的抗肥胖作用，為營養(yǎng)膳食防治肥胖提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 1.1.大鼠原代成熟脂肪細(xì)胞模型的建立
　　 SD大鼠斷頭處死，浸于75％酒精中消毒。
　　 大鼠成熟脂肪細(xì)胞的鑒定：進(jìn)行油紅O-蘇木精染色后顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴存在，呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，

3、符合脂肪細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。
　　 1.2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組
　　 取出的大鼠成熟原代脂肪細(xì)胞分別用1μM、10μM、100μM Cy-3-g處理1h；用不加任何干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照(control)，用1mM的AMPK激動(dòng)劑AICAR作為陽性對(duì)照。
　　 1.3.花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影響
　　 將大鼠原代脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-

4、3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞用試劑盒檢測。
　　 1.4.花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)的影響
　　 將脂肪細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓6～8h，用1μM、10μM、100μM的花色苷干預(yù)1h，每孔加入3H-棕櫚酸2μCi/mL、L-卡尼丁(L-camitine)1mmol/L，孵育后吸棄培養(yǎng)基，測定3H2O放射性。
　　 1.

5、5花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
　　 將脂肪細(xì)胞饑餓6～8h后，分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 1.6花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK活性的影響
　　 將饑餓后的脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞，用AMPK試劑盒檢測AM

6、PK活性。
　　 1.7花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
　　 將饑餓后的脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印記檢測。
　　 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 2.1 Kkay小鼠的喂養(yǎng)
　　 在自然光照(08：00到20：00)和23±3℃的條件下喂養(yǎng)Kkay小鼠。把5周齡的Kkay小鼠隨機(jī)分為2組，每組

7、6只小鼠。其中1組用添加花色苷Cy-3-g(1g/kg)的飼料喂養(yǎng)，另外一組用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。
　　 2.2花色苷對(duì)Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
　　 喂養(yǎng)8周后，處死小鼠，取腹部脂肪組織，稱量重量。稱量Kkay小鼠的5周齡時(shí)的開始體重與花色苷喂養(yǎng)8周后的終體重，并計(jì)算出8周內(nèi)Kkay小鼠的攝食量。
　　 2.3花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
　　 取花

8、色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 2.4花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活性的影響
　　 取花色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集組織中總蛋白用于AMPK活性的檢測。
　　 2.5花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
　　 取花色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織，裂解組織后，收集

9、細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
　　 2.6花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
　　 8周后處死花色苷組和對(duì)照組的Kkay小鼠，取腹部脂肪組織，進(jìn)行石蠟切片HE染色。
　　 研究結(jié)果：
　　 1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 1.1花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響
　　 與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著減少脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量(p＜0.001)，甘油三酯含

10、量分別減少了27.9％、30.5％、45.7％，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，分別相當(dāng)于1mMAICAR處理組的39.4％、43.0％和64.5％。
　　 1.2花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化的影響
　　 與對(duì)照組相比，100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化(p＜0.001)，而1μM、10μM Cy-3-g在促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cy-3-g濃度從低到高其脂肪酸

11、氧化水平分別為對(duì)照組的1.42、1.44、2.15倍。AMPK激動(dòng)劑1mMAICAR處理組為對(duì)照組的2.48倍。與AICAR相比，分別相當(dāng)于1mMAICAR處理組的56.7％、58.1％和86.8％。
　　 1.3花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比，10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白的表達(dá)水平(p＜0.01)，CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的2.1倍和2

12、.3倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。1μM的Cy-3-g處理組CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的1.5倍，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mM AICAR處理組的53.5％、76.2％和84.5％。
　　 1.4花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞ACC磷酸化的影響
　　 與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)ACC的磷酸化(p＜0.001)，ACC磷酸化分別為對(duì)照組的1.3、1.

13、5和1.6倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mMAICAR處理組的69.0％、80.5％和85.3％。
　　 1.5花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK活化的影響
　　 與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK的活性(p＜0.001)，AMPK蛋白活性分別為對(duì)照組的1.35、1.39和1.49倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，

14、相當(dāng)于1mM AICAR處理組的72.5％、77.3％和82.6％。
　　 1.6花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK磷酸化的影響
　　 與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK蛋白磷酸化(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平分別為對(duì)照組的2.2、2.6和2.7倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mMAICAR處理組的71.2％、83.9％和88.

15、5％。
　　 1.7花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK蛋白的影響
　　 與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR對(duì)AMPK蛋白表達(dá)水平無影響(p＞0.05)。
　　 2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 2.1花色苷對(duì)Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
　　 花色苷喂養(yǎng)的Kkay小鼠和對(duì)照組相比，體重、攝食量以及腹部脂肪組織重量都沒有明顯差異(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、>　　 2.2花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK的活性明顯升高(p＜0.001)，AMPK的活性為對(duì)照組的3.8倍，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.3花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK磷酸化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK磷酸的水平明顯升高(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平為對(duì)照組的6.

17、2倍，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.4花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK蛋白表達(dá)的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.5花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)ACC磷酸化的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中ACC磷酸的水平明顯升高(p＜0.001)，ACC蛋白磷酸化水平為對(duì)照組的4.4倍

18、，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.6花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響
　　 與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中CPT-1的表達(dá)水平明顯升高(p＜0.001)，CPT-1蛋白的表達(dá)水平為對(duì)照組的4.1倍，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.7花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
　　 在顯微鏡下可見，與花色苷喂養(yǎng)組相比較，一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組的腹部脂肪細(xì)胞明顯肥大?；ㄉ瘴桂B(yǎng)的Kkay