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      花色苷對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響及其機(jī)制探討.pdf

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      文檔簡介

      1、本次研究擬在前期對(duì)花色苷生物學(xué)作用研究的基礎(chǔ)上,采用大鼠成熟原代脂肪細(xì)胞為模型,選用花色苷中常見的矢車菊素-3-葡萄糖苷作為受試物,觀察花色苷在體外對(duì)大鼠原代脂肪細(xì)胞AMPK活化、脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響,以及在體內(nèi)對(duì)AMPK以及其下游酶類活化的影響,明確花色苷是否能夠通過AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪積聚。
         研究目的:
         1觀察花色苷在體外對(duì)原代脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影響,探討AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)

      2、脂肪積聚的機(jī)制;
         2觀察花色苷在體內(nèi)對(duì)脂肪細(xì)胞的作用,探討與AMPK通路的相關(guān)機(jī)制,以及花色苷的抗肥胖作用,為營養(yǎng)膳食防治肥胖提供理論依據(jù)。
         研究方法:
         1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
         1.1.大鼠原代成熟脂肪細(xì)胞模型的建立
         SD大鼠斷頭處死,浸于75%酒精中消毒。
         大鼠成熟脂肪細(xì)胞的鑒定:進(jìn)行油紅O-蘇木精染色后顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴存在,呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,

      3、符合脂肪細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。
         1.2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組
         取出的大鼠成熟原代脂肪細(xì)胞分別用1μM、10μM、100μM Cy-3-g處理1h;用不加任何干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照(control),用1mM的AMPK激動(dòng)劑AICAR作為陽性對(duì)照。
         1.3.花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞甘油三酯(Triglyceride,TG)含量的影響
         將大鼠原代脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-

      4、3-g和1mM AICAR孵育1h后,收集細(xì)胞用試劑盒檢測。
         1.4.花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,F(xiàn)AO)的影響
         將脂肪細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓6~8h,用1μM、10μM、100μM的花色苷干預(yù)1h,每孔加入3H-棕櫚酸2μCi/mL、L-卡尼丁(L-camitine)1mmol/L,孵育后吸棄培養(yǎng)基,測定3H2O放射性。
         1.

      5、5花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
         將脂肪細(xì)胞饑餓6~8h后,分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h,收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
         1.6花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK活性的影響
         將饑餓后的脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后,收集細(xì)胞,用AMPK試劑盒檢測AM

      6、PK活性。
         1.7花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
         將饑餓后的脂肪細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后,收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印記檢測。
         2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
         2.1 Kkay小鼠的喂養(yǎng)
         在自然光照(08:00到20:00)和23±3℃的條件下喂養(yǎng)Kkay小鼠。把5周齡的Kkay小鼠隨機(jī)分為2組,每組

      7、6只小鼠。其中1組用添加花色苷Cy-3-g(1g/kg)的飼料喂養(yǎng),另外一組用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。
         2.2花色苷對(duì)Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
         喂養(yǎng)8周后,處死小鼠,取腹部脂肪組織,稱量重量。稱量Kkay小鼠的5周齡時(shí)的開始體重與花色苷喂養(yǎng)8周后的終體重,并計(jì)算出8周內(nèi)Kkay小鼠的攝食量。
         2.3花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影響
         取花

      8、色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織,裂解組織后,收集細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
         2.4花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活性的影響
         取花色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織,裂解組織后,收集組織中總蛋白用于AMPK活性的檢測。
         2.5花色苷Cy-3-g對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的影響
         取花色甘組和對(duì)照組Kkay小鼠的腹部脂肪組織,裂解組織后,收集

      9、細(xì)胞總蛋白用于免疫印跡檢測。
         2.6花色苷Cy-3-g對(duì)小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
         8周后處死花色苷組和對(duì)照組的Kkay小鼠,取腹部脂肪組織,進(jìn)行石蠟切片HE染色。
         研究結(jié)果:
         1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
         1.1花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響
         與對(duì)照組相比,1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著減少脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量(p<0.001),甘油三酯含

      10、量分別減少了27.9%、30.5%、45.7%,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比,分別相當(dāng)于1mMAICAR處理組的39.4%、43.0%和64.5%。
         1.2花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化的影響
         與對(duì)照組相比,100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化(p<0.001),而1μM、10μM Cy-3-g在促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸氧化上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cy-3-g濃度從低到高其脂肪酸

      11、氧化水平分別為對(duì)照組的1.42、1.44、2.15倍。AMPK激動(dòng)劑1mMAICAR處理組為對(duì)照組的2.48倍。與AICAR相比,分別相當(dāng)于1mMAICAR處理組的56.7%、58.1%和86.8%。
         1.3花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響
         與對(duì)照組相比,10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白的表達(dá)水平(p<0.01),CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的2.1倍和2

      12、.3倍,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。1μM的Cy-3-g處理組CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的1.5倍,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比,相當(dāng)于1mM AICAR處理組的53.5%、76.2%和84.5%。
         1.4花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞ACC磷酸化的影響
         與對(duì)照組相比,1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)ACC的磷酸化(p<0.001),ACC磷酸化分別為對(duì)照組的1.3、1.

      13、5和1.6倍,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比,相當(dāng)于1mMAICAR處理組的69.0%、80.5%和85.3%。
         1.5花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK活化的影響
         與對(duì)照組相比,1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK的活性(p<0.001),AMPK蛋白活性分別為對(duì)照組的1.35、1.39和1.49倍,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比,

      14、相當(dāng)于1mM AICAR處理組的72.5%、77.3%和82.6%。
         1.6花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK磷酸化的影響
         與對(duì)照組相比,1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)AMPK蛋白磷酸化(p<0.001),AMPK蛋白磷酸化水平分別為對(duì)照組的2.2、2.6和2.7倍,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比,相當(dāng)于1mMAICAR處理組的71.2%、83.9%和88.

      15、5%。
         1.7花色苷對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞AMPK蛋白的影響
         與對(duì)照組相比,1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR對(duì)AMPK蛋白表達(dá)水平無影響(p>0.05)。
         2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
         2.1花色苷對(duì)Kkay小鼠體重、攝食量和腹部脂肪的影響
         花色苷喂養(yǎng)的Kkay小鼠和對(duì)照組相比,體重、攝食量以及腹部脂肪組織重量都沒有明顯差異(p>0.05),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      16、>   2.2花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK活化的影響
         與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比,花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK的活性明顯升高(p<0.001),AMPK的活性為對(duì)照組的3.8倍,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
         2.3花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK磷酸化的影響
         與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比,花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK磷酸的水平明顯升高(p<0.001),AMPK蛋白磷酸化水平為對(duì)照組的6.

      17、2倍,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
         2.4花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)AMPK蛋白表達(dá)的影響
         與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比,花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中AMPK表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(p>0.05),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
         2.5花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)ACC磷酸化的影響
         與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比,花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中ACC磷酸的水平明顯升高(p<0.001),ACC蛋白磷酸化水平為對(duì)照組的4.4倍

      18、,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
         2.6花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織內(nèi)CPT-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響
         與一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組相比,花色苷喂養(yǎng)組小鼠的組織中CPT-1的表達(dá)水平明顯升高(p<0.001),CPT-1蛋白的表達(dá)水平為對(duì)照組的4.1倍,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
         2.7花色苷對(duì)小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響
         在顯微鏡下可見,與花色苷喂養(yǎng)組相比較,一般飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組的腹部脂肪細(xì)胞明顯肥大?;ㄉ瘴桂B(yǎng)的Kkay

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