miRNA-720對TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡的作用及機制.pdf

1、研究目的：1.建立原代人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)體外培養(yǎng)的方法，討論TNF-α對該細胞凋亡程度的影響;2.根據發(fā)表的論文中相同篩選方式的結果，探討miRNA-720在HUVEC凋亡中的調節(jié)功能;3.研究miRNA-720對細胞凋亡影響的機制。
　　研究方法：本實驗分為三部分:1原代細胞的培養(yǎng)方法參考相關文獻報道并加以改進，通過觀察細胞形態(tài)和利用免疫細胞化學法對細胞進行鑒定;用四種方法(電鏡觀察，Hoechst33258熒光染色

2、，TUNEL法以及western blot)檢測HUVEC的凋亡程度;2參考文獻中有關芯片檢測結果，選定miRNA-720為有意義的共同差異表達microRNA。采用miRNA-720前體(pre-miR-720)瞬時轉染HUVEC從而使得內皮細胞抑制或者過表達該microRNA，設立空白對照組，用實時熒光定量PCR法檢測轉染的效率。然后用TNF-α干預轉染后的HUVEC，再次通過Hoechst33258熒光染色、TUNEL法、實時定量

3、PCR法以及western blot等方法檢測不同轉染組與對照組的內皮細胞凋亡程度改變;3使用生物信息學軟件分析，結合文獻查詢，預測與凋亡相關的miR-720的靶基因;用熒光素酶報告基因法驗證DNMT3A是否為miR-720作用的靶基因;用miRNA-720抑制劑轉染HUVEC，采用實時熒光定量PCR法和western blot觀察其是否引起靶基因表達增多;用DNA Methylation PCR檢測細胞內基因甲基化的變化。
　　

4、研究結果：(1)經相差顯微鏡觀察以及Ⅷ因子染色證明培養(yǎng)的細胞中98％為HUVEC，臺盼藍染色顯示95％以上細胞的存活狀態(tài)良好，TNF-α能引起HUVEC凋亡;(2) Hoechst33258熒光染色，TUNEL染色，實時熒光定量PCR及western blot結果顯示: miRNA-720抑制劑使得TNF-α誘導的HUVEC凋亡數量明顯減少，而miRNA-720的過表達使得TNF-α誘導的HUVEC凋亡數明顯增加;(3)經過生物信息學軟

5、件的分析預測，DNMT3A很有可能是miRNA-720的候選靶基因，經過熒光素酶報告基因法，實時定量PCR，Western blot和MSP證實miRNA-720抑制組該基因的表達有顯著提升。
　　研究結論：(1)本研究以成功建立HUVEC體外培養(yǎng)方法為基礎，建立了TNF-α誘導HUVEC凋亡的實驗模型;(2) miRNA-720在TNF-α誘導的HUVEC細胞凋亡中表達明顯上升，能明顯促進細胞凋亡，破壞細胞生存。(3) miRN