CRP2在TNF-α介導的A549細胞炎癥-氧化損傷中對Nox1基因的表達調控.pdf

1、研究背景：
　　炎癥反應與氧化應激密切相關，炎癥失衡往往伴隨氧化應激損傷，在生物進化中，炎癥反應與氧化應激應相對協(xié)調，既可有效清除抗原，又使炎癥反應與氧化應激維持在合理水平，減少組織細胞的損傷。如打破炎癥與氧化應激的平衡，將對生物機體造成巨大的損傷。眾多文獻表明炎癥反應失控和氧化應激過度激活是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）重要的發(fā)病機制，對炎癥反應及繼發(fā)的氧化應激進行調控是減輕ALI的關鍵。急性呼吸窘迫綜

2、合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是嚴重的ALI，在過去的幾十年中，盡管人們對ALI/ARDS的發(fā)病機制認識和臨床救治措施方面有了長足的進步，但ARDS患者的死亡率仍居高不下。因本病起病急驟，發(fā)展迅速，病死率高，尋找有效的ALI/ARDS治療新策略仍是當前危重病醫(yī)學領域的研究熱點和迫切任務。
　　肺泡Ⅱ型上皮細胞作為呼吸膜的重要組成，是肺泡上皮的“干細胞”，可化生為I型肺泡上皮

3、細胞合成并分泌表面活性物質維持肺泡正常形態(tài)。在急性肺損傷中減輕炎癥反應并繼發(fā)的氧化損傷對維持肺泡Ⅱ型上皮細胞的結構完整及增殖修復具有重要作用，從而可減輕急性肺損傷的發(fā)生和進展。在 ARDS小鼠模型中，炎癥和氧化應激水平呈正相關，且肺臟是過度氧化應激首要打擊的靶器官，肺組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平高的小鼠肺部損傷更嚴重。Syrkina等研究發(fā)現(xiàn)，ARDS小鼠早期即出現(xiàn)氧化與抗氧化失衡，抗氧化劑乙

4、酰半胱氨酸能抑制ARDS小鼠肺內還原型谷胱甘肽的下降，減輕中性粒細胞浸潤，降低肺泡灌洗液中炎癥因子的水平，減少氣道結構細胞凋亡。此外ROS的大量生成后可介導炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的生成。TNF-α是介導ALI的早期細胞因子之一，且 TNF-α是啟動和放大炎癥反應的主要炎癥介質，TNF-α能誘導內皮細胞及中性粒細胞產生大量ROS，對結構細胞造成氧化損傷，最終引起細胞壞死。研究證實動物模型中血清或肺泡灌洗液中TNF-α濃度與ALI

5、嚴重程度正相關。急性肺損傷往往伴隨肺結構細胞的損傷，因此本研究沿用既往本實驗室使用的具有代表性的炎癥因子 TNF-α刺激肺泡上皮細胞 A549體外復制ALI時肺結構細胞損傷的炎癥-氧化損傷模型。
　　煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase, Nox）是催化生成ROS的重要氧化酶。已有眾多研究表明Nox活化，使H2O2大量生成，并引起細胞損傷。目前發(fā)現(xiàn)存在Nox1-5等亞型，其中Nox1主要表達于肺泡上皮細胞。本

6、實驗室前期研究轉錄因子NF-κB、SP1對Nox1的調控中，沉默NF-κB、SP1后能降低 Nox1的表達，且能降低活性氧的表達，降低細胞的凋亡率。Nox1是活性氧產生的重要來源，且基因轉錄水平的調控是基因表達最關鍵的步驟，因此對Nox1轉錄進行調控，使其活性氧在炎癥反應時維持較低水平，能減輕內源性活性氧的生成，減輕對細胞的氧化損傷。
　　本實驗室前期在研究TNF-α刺激 A549細胞 Nox1啟動子差異結合蛋白的篩選實驗中，以T

7、NF-α刺激肺泡上皮細胞，模擬急性肺損傷體外細胞炎癥-氧化損傷模型，通過DNA-pull down、二維凝膠電泳及質譜分析發(fā)現(xiàn)Nox1啟動子區(qū)域差異結合蛋白13種，我們選取了其中一個具有鋅指結構的蛋白 CRP2，其編碼基因為 CSRP2。CRP2由193個氨基酸組成，分子量約為21KD，CRP2蛋白的特點是含有2個LIM結構域，每個LIM結構域后跟著一個由12個氨基酸殘基組成的甘氨酸豐富的重復序列，兩個 LIM結構域之間還有一個核定位信

8、號(KKYGPK)。CPR2屬于 LIM蛋白，LIM蛋白是一類富含半胱氨酸、具有一個或多個鋅指結構的蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的LIM蛋白已有60多種，參與了細胞基因轉錄調控、細胞骨架功能調節(jié)等多種生理效應。LIM蛋白分為四類：LIM-HD，LIM-Only，LIM-K和含一端 LIM結構域的LIM蛋白。CRP屬于LIM-Only蛋白，其特點是含有一個或多個 LIM結構域，但無 DNA結合的結構域，故CRP2雖為具有鋅指結構的蛋白，但不具有與DNA

9、直接結合的能力。CRP2可定位于細胞胞漿及胞核，至今為止文獻報道CRPs能和核蛋白結合，特別是與轉錄因子結合，并且CRP2本身也是其重要的轉錄因子。關于CSRP家族的研究，早期一直聚焦在平滑肌細胞，后來逐漸擴展到動、靜脈血管平滑肌細胞。后來，J?rvinen PM等研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性肺間質纖維化小鼠肺內發(fā)現(xiàn)CRP1/CRP2的表達。本實驗室前期通過構建CSRP2真核表達載體轉染A549細胞，通過免疫熒光實驗顯示CRP2蛋白在TNF-α刺激

10、1h下活化后濃聚于核膜，并部分入核，同時伴有活性氧生成減少。我們推測CRP2在TNF-α的刺激下活化入核并參與了對Nox1基因的調控。
　　目前為止尚沒有文獻表明 CRP2直接作為轉錄因子發(fā)揮調節(jié)作用，但其可通過具有調節(jié)作用的靶蛋白（如轉錄因子）結合而發(fā)揮轉錄調節(jié)作用。Kong等[18]研究表明，定位于核的CRP2可調節(jié)肌細胞的MyoD轉錄因子家族；Yet等研究表明，在CSRP2的5’端有一潛在的轉錄起始位點，具有與GATA、SP

11、1等轉錄因子結合的可能，瞬時轉染CSRP2可顯著提高大鼠動脈平滑肌細胞熒光素酶活性，但具體機制仍未見明顯文獻報道。另有文獻報道 CRP2能與SRF和GATA-6形成復合體后參與對基因的調控，并且CRP2在調控過程中起到轉錄輔因子的作用。在平滑肌細胞，CRP2可被 SRF、hlcalponin、SM22等因子激活而活化，通過其C端LIM結構域作為SRF與GATA6的橋接分子誘導平滑肌的轉分化。
　　綜合國內外文獻的報道后，我們利用生

12、物信息學軟件分析結果顯示，我們前期構建Nox1啟動子區(qū)域（1415bp）范圍內存在兩個SRF結合元件，而無GATA6的結合位點。我們推測CRP2活化入核后可能通過與SRF結合，共同調控Nox1的轉錄過程。明確CRP2對Nox1的轉錄調控，通過調節(jié)CSRP2的活性調控Nox1的活性，從而調控活性氧的生成。CRP2對Nox1轉錄調控機制的闡明為ARDS過程中炎癥繼發(fā)氧化應激損傷的機制研究奠定基礎。
　　研究目的：評估CRP2作為轉錄因

13、子是否直接或間接參與了對Nox1的轉錄調控；探討CRP2在TNF-α介導的A549細胞中對Nox1活化表達的調控機制；探索CRP2在Nox1啟動子區(qū)域的結合方式。
　　方法：
　　1.Nox1啟動子區(qū)差異結合蛋白CRP2的確認及活性鑒定
　　1.1 制備生物素標記Nox1啟動子DNA探針PGL3-Basic-Nox1重組質粒為本實驗室前期所保存，按分子克隆的方法擴增PGL3-Basic-Nox1重組質粒，提取 PGL3

14、-Basic-Nox1重組質粒作為模板，PCR的方法制備生物素標記Nox1啟動子探針，PCR產物行1％瓊脂糖凝膠電泳，按大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明切膠回收Nox1啟動子DNA探針。
　　1.2 DNA pull-down實驗實驗分組：對照組、TNF-α刺激組。
　　將3~5代生長良好的A549細胞以1×105/ml接種于15cm細胞培養(yǎng)皿，待貼壁細胞融合至70%~80%時，更換為含3%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8~12h

15、（饑餓處理）， TNF-α刺激組細胞給予含 TNF-α（10ng/ml）的3%血清培養(yǎng)基、對照組給予等量含3%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，刺激1h后收集細胞沉淀。按照武漢博士德胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒說明書進行胞漿胞核蛋白抽提，按BCA說明書測定核蛋白濃度。將兩組核蛋白按Dynabeads kilobase BINDERTMKit說明書進行DNA pull-down實驗，將細胞核蛋白Nox1啟動子區(qū)結合蛋白洗脫。
　　1.3 Wester

16、n-blot法檢測差異蛋白CRP2的表達實驗分組：對照組、TNF-α刺激組。Western-blot檢測洗脫蛋白CRP2的表達水平。
　　1.4 構建并鑒定真核表達質粒PcDNA3-CSRP2-HA據GeneBank中人CSRP2 CDS序列設計并合成引物，提取A549細胞總RNA，并將其逆轉錄成cDNA作為模板，進行PCR擴增，獲得CSRP2目的基因后，再與PcDNA3-HA載體進行連接重組，構建 PcDNA3-CSRP2-HA

17、真核表達質粒，經限制性內切酶消化、PCR及 DNA序列測序分析等方法鑒定后，瞬時轉染入A549細胞，Western blot法檢驗CSRP2蛋白表達。
　　1.5 熒光素酶報告基因檢測CRP2對Nox1基因轉錄表達水平的影響實驗分組：
　　A.空白組（無轉染組）
　　B.轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1組C.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1組D. TNF-α刺激組

18、E.轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組F.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組將 A549細胞以1×105/ml接種于24孔板，待長至80%~90%時，按Lipofectamine LTX plus的說明書進行轉染，共轉染時分別進行pcDNA3-CSRP2-HA/ pcDNA3-HA質粒和PGL3-Basic-Nox1質粒（本實驗前期構建）共轉染入A5

19、49細胞。轉染6h后換液繼續(xù)培養(yǎng)4h，TNF-α組給予終濃度為10ng/ml的TNF-α培養(yǎng)基500ul，對照組加入等量1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測熒光素酶活性。
　　2.CRP2對TNF-α介導的A549細胞中Nox1基因的調控
　　2.1 CSRP2沉默對Nox1基因mRNA、蛋白表達水平的影響實驗分組:空白組（不加任何干預因素）、TNF-α組（僅用TNF-α刺激）、CSRP2 siRNA組（預轉染CSRP2 s

20、iRNA且用TNF-α刺激）、siRNA control陰性對照組（預轉染陰性對照siRNA且用TNF-α刺激）。RT-PCR檢測CSRP2 mRNA沉默效率及沉默后A549細胞的Nox1 mRNA水平；Western-blot法檢測總Nox1、胞漿胞核CRP2蛋白的表達水平。
　　2.2 CSRP2沉默對活性氧表達水平的影響實驗分組：同3.2.1。DCFH-DA法檢測A549細胞ROS表達水平，同時用熒光顯微鏡采集圖像。

21、　　3.CRP2在Nox1啟動子區(qū)域結合方式的研究
　　3.1 缺失不同SRF結合位點的Nox1啟動子螢光素酶表達載體的構建以前期構建的PGL3-Basic-Nox1（Nox1基因啟動子全長1415bp）為模板，設計兩個不同缺失SRF結合位點的引物，及兩個SRF結合位點同時缺失的引物，進行PCR擴增，PCR產物連接到PGL3-Basic表達載體，進行測序驗證。
　　3.2 缺失不同SRF結合位點的Nox1啟動子片段螢光素酶表

22、達載體的活性鑒定。采用螢光素酶報告系統(tǒng)檢測相對螢光素酶活性。實驗分組：
　　A.空白組
　　B. TNF-α刺激組C.轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組D.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α刺激組E.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-SRF1結合位點缺失+TNF-α刺激組F.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-

23、Basic–SRF2結合位點缺失+TNF-α刺激組G.轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-SRF（1、2）結合位點同時缺失+TNF-α刺激組3.4統(tǒng)計學方法采用 spss13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據以均數(shù)±標準差（X?s）表示。CSRP2沉默對Nox1基因mRNA、蛋白、活性氧表達水平的影響檢測用單因素方差分析。首先進行方差齊性和總體組間差異檢驗，總體有差異后，進行多重比較，方差齊用LSD，方差不齊用

24、Dunnett檢驗。涉及轉染DNA質粒及TNF-α刺激等多個處理因素的實驗中，統(tǒng)計學方法采用析因分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.Nox1啟動子區(qū)差異結合蛋白CRP2的確認及活性鑒定
　　1.1 TNF-α組的CRP2蛋白表達水平較空白組明顯上調。
　　1.2 成功構建 pcDNA3-CSRP2-HA真核表達質粒， Western-blot結果顯示pcDNA3.1-CSRP2-HA能夠在A54

25、9細胞中表達。
　　1.3 經單因素方差分析，靜息狀態(tài)下，pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1轉染組熒光素酶活性顯著低于pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1轉染組，而顯著高于空白組（F=260.753，P=0.000）；在TNF-α刺激下，轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組熒光素酶活性顯著低于轉染 pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox

26、1+TNF-α轉染組，而顯著高于TNF-α組（F=446.061，P=0.000）。經單因素方差分析，TNF-α刺激后，TNF-α組較空白對照組(即無轉染組)熒光素酶活性顯著升高（F=54.753，P=0.002）；轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組熒光素酶活性高于轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1組（F=360.488，P=0.000）；轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3

27、-Basic-Nox1+TNF-α組組熒光素酶活性高于轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1組（F=117.988，P=0.000）。經析因分析，TNF-α與質粒轉染兩種處理因素間有交互效應（F=15.000，P=0.010）。
　　2.CRP2對TNF-α介導的A549細胞中Nox1基因的調控
　　2.1 各組A549細胞CSRP2 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=800.366， P=0

28、.000）。經TNF-α刺激，A549細胞CSRP2 mRNA表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞CSRP2 mRNA表達水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.2 各組A549細胞CRP2胞漿蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=62.081， P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞胞漿CRP2蛋白表達水

29、平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞胞漿CRP2蛋白表達水平較 TNF-α組、陰性對照組下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.3 各組A549細胞CRP2胞核蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=45.609， P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞胞核CRP2蛋白表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA

30、組，A549細胞胞核CRP2蛋白表達水平較 TNF-α組、陰性對照組下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.4 各組A549細胞Nox1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=298.868， P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞Nox1 mRNA表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞Nox1 mRNA表達水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對

31、照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.5 各組 A549細胞 Nox1蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=39.094， P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞Nox1蛋白表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞Nox1蛋白表達水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.6 各組A549細胞

32、活性氧表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=29.121，P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞活性氧表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞活性氧表達水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　各組A549細胞活性氧表達陽性百分比有統(tǒng)計學意義（F=148.167，P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞活性氧活性

33、氧陽性百分比表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染CSRP2 siRNA組，A549細胞活性氧表達水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.CRP2在Nox1啟動子區(qū)域結合方式的研究
　　3.1 成功構建了不同SRF結合位點缺失的Nox1啟動子熒光素酶表達載體。
　　3.2 經單因素方差分析各組A549細胞熒光素酶活性表達水平差異有統(tǒng)計學意義

34、（F=31.788，P=0.000）。經TNF-α刺激，A549細胞熒光素酶活性表達水平較空白對照組上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染pcDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組較空白組和TNF-α刺激組，A549細胞熒光素酶活性表達水平明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組，A549細胞熒光素酶活性表達水平較預轉染p

35、cDNA3-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF1結合位點缺失+TNF-α組較pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組，A549細胞熒光素酶活性表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。預轉染PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-SRF2結合位點缺失+TNF

36、-α組， A549細胞熒光素酶活性表達水平較PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1+TNF-α組、PcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF1結合位點缺失+TNF-α組明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。預轉染pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-Nox1-SRF(1、2)結合位點同時缺失+TNF-α組較pcDNA3-CSRP2-HA+PGL3-Basic-No