大鼠鈍性脊髓損傷后骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）的表達分布及作用.pdf

1、脊髓損傷修復是目前神經(jīng)科學研究領(lǐng)域最重要的課題之一。脊髓損傷的病理生理改變由原發(fā)性損傷及一系列的繼發(fā)性損傷所致，導致的功能結(jié)局主要是運動功能減退或完全喪失，感覺功能的異常如神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展。研究表明，脊髓損傷后導致?lián)p傷局部及相鄰部位的膠質(zhì)細胞興奮激活，即反應性膠質(zhì)炎，并導致膠質(zhì)疤痕形成，膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕是軸突再生的重要屏障，它影響軸突再生、髓鞘再形成與突觸再建立，是脊髓損傷后感覺與運動神經(jīng)功能障礙的重要原因之一。但是，對于調(diào)控脊髓損

2、傷后膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)機制尚不清楚。 在胚胎發(fā)育期，一些決定細胞命運的基因如Numb、Notch-1、Shh、BMPs等表達豐富，但成年后大多數(shù)減弱或功能處于靜止狀態(tài)。組織損傷后，一些基因又重新表達或表達發(fā)生改變。組織損傷后的修復過程包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復至少部分地重演了發(fā)育時期的組織生成過程。因此，研究這些基因在脊髓損傷后的表達及功能意義對于闡明調(diào)控脊髓損傷修復的內(nèi)在機制具有重要意義。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(

3、Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族(transforming growth factor-β、TGF-β)成員。BMPs在骨骼的發(fā)育、骨形態(tài)的發(fā)生中起重要作用。同時，BMPs又具有廣泛的生物學活性，是多功能的蛋白質(zhì)。BMPs調(diào)控脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)形成和分化許多關(guān)鍵步驟，作用于神經(jīng)發(fā)育的不同階段，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域調(diào)節(jié)細胞命運、增殖與分化。不同的類型的BMP有不同的功能作用，BMP

4、2、4、7在膠質(zhì)細胞的發(fā)育中起重要作用，它使神經(jīng)干細胞分化為星形膠質(zhì)細胞，它誘導星形膠質(zhì)細胞的形成。但是BMPs在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓損傷中的作用的研究甚少。聯(lián)系BMPs及其受體在胚胎發(fā)育中的作用，推測BMP信號可能促進脊髓損傷后星形膠質(zhì)細胞反應而促進伴隨損傷出現(xiàn)的膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕的形成，因此可能成為調(diào)節(jié)脊髓損傷后膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕形成的重要細胞信號?；谝陨涎芯勘尘凹巴茰y，本研究將觀察脊髓損傷后BMP信號的表達及作用：首先，檢測B

5、MPs及其受體在正常成年大鼠脊髓中的表達分布；其次，檢測鈍性脊髓損傷后BMPs及其受體的表達改變：在上述研究基礎(chǔ)上，應用BMP阻斷劑Noggin局部顯微注射治療脊髓損傷，觀察脊髓膠質(zhì)反應如對膠質(zhì)炎及膠質(zhì)活性的影響。本研究可能為探索脊髓損傷與保護機制并尋求有效的治療方法提供新的思路和實驗基礎(chǔ)。 針對這一研究目的，我們采用了下列研究方法：應用免疫組織化學方法檢測BMPs和其下游信號轉(zhuǎn)導分子磷酸化的Smad蛋白(pSmad1/5/8)

6、及BMPs受體在正常成年大鼠脊髓中的表達分布；應用Scheff SW描述的鈍性脊髓損傷動物模型，采用免疫組織化學方法及West Blot方法，觀察脊髓損傷1、3、7、14、28、56天后，BMPs及其受體及pSmad1/5/8的表達分布；在上述研究基礎(chǔ)上，利用BMPs阻斷劑顯微注射至損傷的脊髓阻斷BMPs的作用，觀察膠質(zhì)活性的改變，并分析這些改變的可能意義。 研究結(jié)果顯示： 1．BMPs及其受體在成年大鼠脊髓的表達：

7、 免疫組化未檢測出BMP2、4在正常成年大鼠脊髓中表達，但BMP7在所有的少突膠質(zhì)細胞及前角運動神經(jīng)元表達。pSmad1/5/8在所有APC陽性的少突膠質(zhì)細胞核及前角運動神經(jīng)元細胞核均表達。 BMPR Ia型受體在脊髓中央管室管膜細胞強表達，免疫雙標顯示這些細胞是3CB2(放射狀膠質(zhì)的標志)陽性細胞。脊髓白質(zhì)周邊部位的部分3CB2陽性細胞表達Ia。在灰質(zhì)及白質(zhì)的少突膠質(zhì)細胞(APC陽性細胞表達Ia)及前角運動神經(jīng)元(NeuN

8、陽性細胞表達Ia)，Ia有中等強度的表達。部分GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞及OX-42陽性小膠質(zhì)細胞表達Ia。Ib型受體主要在少突膠質(zhì)細胞、軸突及部分星形膠質(zhì)細胞內(nèi)表達，中央管室膜細胞及運動神經(jīng)元均不表達Ib。Ⅱ型受體在少突膠質(zhì)細胞及前角運動神經(jīng)元有表達，在部分星形膠質(zhì)細胞中表達。 2．BMPs及其受體在成年大鼠鈍性脊髓損傷后的表達： BMP2、4的表達：損傷3天后，在星形膠質(zhì)細胞即出BMP2、4的表達。損傷后7-14天，

9、損傷中心位置，在灰質(zhì)及殘余的白質(zhì)肥大的星形膠質(zhì)細胞體，出現(xiàn)BMP2、4最強表達，強表達持續(xù)到損傷后2個月。在距損傷中心頭、尾側(cè)0.5cm，仍有BMP2、4的較強表達。距損傷中心越遠表達越弱。BMP7的表達：損傷1天后，星形膠質(zhì)細胞BMP7的表達明顯增加，損傷后14天表達激劇增多，高表達持續(xù)至損傷后1個月以上。而損傷后第一天，在少突膠質(zhì)細胞BMP7表達減少，但大多數(shù)少突膠質(zhì)細胞仍表達BMP7，損傷后3天到28天，許多少突膠質(zhì)細胞不表達BM

10、P7。pSmad1/5/8的表達：損傷后1天，大多數(shù)．APC陽性的少突膠質(zhì)細胞表達pSmad1/5/8，但是，一些APC陽性的少突膠質(zhì)細胞不表達pSmad1/5/8。 損傷后7、14、28天，一些APC陽性的少突膠質(zhì)細胞仍不表達pSmad1/5/8，不表達pSmad1/5/8的少突膠質(zhì)細胞核出現(xiàn)固縮、色變暗、甚至出現(xiàn)核分裂，提示這些細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征。 BMPs受體的表達：損傷后7、14、28、56天，在損傷中心及頭、尾側(cè)脊

11、髓白質(zhì)的星形膠質(zhì)細胞強表達Ia，免疫雙標顯示，3CB2陽性的放射狀膠質(zhì)強表達Ia，3CB2陽性細胞也是GFAP陽性細胞強表達Ia，而3CB2陰性GFAP陽性細胞不表達Ia。 3．Noggin明顯抑制脊髓損傷誘導的反應性膠質(zhì)增生： 150kdynes IH脊髓損傷后3天，損傷部位局部注射Noggin一星期后，對脊髓組織學及免疫組化分析表明，應用Noggin阻斷BMPs信號，抑制星形膠質(zhì)細胞增生，抑制Brdu陽性細胞的數(shù)量，

12、提示對損傷后的炎癥反應有明顯的抑制作用。 綜合上述，我們得出以下主要研究結(jié)論： 1．雖然BMPs是一種在胚胎發(fā)育期豐富表達且決定細胞命運的基因，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成年大鼠的脊髓中，BMP2、4、7、pSmad1/5/8和BMPR均有表達。這些蛋白表達保留至成年期，可能在組織損傷時重現(xiàn)胚胎期的表達特征和功能，即可能參與組織損傷機制，也可能啟動修復程序。 2．鈍性脊髓損傷后，隨著膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕形成，BMP2、4、7

13、及其受體在星形膠質(zhì)細胞中表達激劇上升，表明BMP信號系統(tǒng)可能促進炎性反應，抑制神經(jīng)軸突再生而導致神經(jīng)功能異常。 3．BMP信號的拮抗劑Noggin注射至損傷的脊髓局部阻斷BMP信號，可明顯抑制星形膠質(zhì)細胞表達CSPG-versicon，并抑制其炎癥反應及星形膠質(zhì)增生反應，將可能有助于軸突的再生，為神經(jīng)功能恢復提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 4．綜合本研究結(jié)果，BMPs及其受體的表達保留至成年期，且在脊髓鈍性損傷后表達增強，而以其拮抗劑

14、阻斷信號表達可明顯抑制其炎癥反應，表明BMP信號是參與脊髓的損傷與修復機制，從而提示，調(diào)節(jié)BMPs及其受體的表達或控制其信號轉(zhuǎn)導將成為治療脊髓損傷的重要途徑，為進一步脊髓損傷研究提供了方向。 未來的方向： 基于以上研究結(jié)果，調(diào)節(jié)BMPs及其受體的表達或控制其信號轉(zhuǎn)導將成為治療脊髓損傷的重要途徑，為進一步脊髓損傷研究提供了方向。同時，將密切結(jié)合本學科有關(guān)疼痛治療，運動功能康復等的治療進展，不僅可以更明確闡明BMPs及其受體