應用慢病毒載體介導的RNAi技術研究Skp2基因對子宮內膜癌HEC-1-A細胞周期、凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的：構建S期激酶相關蛋白2(Skp2)特異性RNA干擾慢病毒表達載體，抑制子宮內膜癌HEC-1-A細胞中Skp2基因的表達。研究Skp2基因沉默后P27、CyclinD1、Caspase-3表達的變化，以及對HEC-1-A細胞周期、凋亡和增殖的影響。 方法：構建U6啟動子驅動、帶有綠色熒光蛋白(GFP)標志的、表達針對Skp2基因的慢病毒LV-shRNA載體，轉染HEC-1-A細胞，同時以轉染陰性載體的HEC-1-A細胞作為對

2、照。熒光顯微鏡觀察GFP表達以確定轉染效率，采用RT-PCR、熒光實時定量PCR在mRNA水平檢測Skp2基因表達的變化，采用Western blotting在蛋白質水平檢測Skp2基因表達的變化，以明確RNAi的抑制效率。并運用同樣的方法分別從mRNA和/或蛋白質水平檢測P27、CyclinD1、Caspase-3表達的變化，通過細胞計數(shù)、CCK-8法、流式細胞技術檢測Skp2 RNA干擾后細胞增殖、凋亡和細胞周期的變化，分析Skp2

3、基因沉默對P27、CyclinD1、Caspase-3表達水平以及細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。 結果：1.成功構建了四對針對Skp2基因不同位點的RNAi慢病毒表達載體，經PCR和測序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點完全正確；2.在293T細胞中包裝慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清；3.利用重組慢病毒載體將Skp2 shRNA轉導入子宮內膜癌HEC-1-A細胞中，其轉染效率可達到70％以上；4.構建的重組慢病毒LV-Skp2-1

4、、LV-Skp2-2、LV-Skp2-3、LV-Skp2-4無論在mRNA水平還是在蛋白質水平均能抑制Skp2基因的表達，其中LV-Skp2-3、LV-Skp2-4的基因沉默效果較好，抑制率可以達到50％以上；5.利用RNAi技術沉默Skp2基因表達，對p27、cyclinD1的mRNA表達水平沒有影響，卻可以在蛋白質水平上調P27的表達，并下調CyclinD1的表達；6.抑制Skp2基因表達影響HEC-1-A細胞周期的進程，使其發(fā)生G

5、2/M期阻滯；7.下調Skp2基因表達抑制了HEC-1-A細胞增殖，使其生長速度減緩。8.抑制Skp2基因表達對HEC-1-A細胞凋亡沒有顯著影響。 結論：利用RNA干擾技術，可有效下調Skp2基因的表達，引起P27蛋白表達的上調和CyclinD1蛋白表達的下調，但對p27、cyclinD1的mRNA表達水平沒有影響。Skp2基因的沉默影響HEC-1-A的細胞周期，發(fā)生G2/M期阻滯，進而抑制了細胞的增殖，使細胞的生長速度減慢，