繁縷抗病毒活性蛋白的初步研究.pdf

1、繁縷(Stellaria media(L.) Villars)為石竹科(Caryophyllaceae)繁縷屬(Stellar iaL.)植物，是一種藥食同源植物。繁縷全草入藥，有多種藥用功效，尤其繁縷鮮汁液在治療皰疹等病毒性皮膚病方面有顯著療效。為闡明其藥效物質(zhì)，本研究以抗單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)的活性為導(dǎo)向，從繁縷中分離純化得到一種新的抗HSV-2活性蛋白，初步對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)、質(zhì)譜和生物活性研究，發(fā)現(xiàn)其具有過(guò)氧化物酶(PO

2、D)和核糖體失活蛋白(RIP)的相關(guān)活性；本文同時(shí)對(duì)繁縷RIP基因的克隆和表達(dá)展開(kāi)研究，首次克隆到Q1、Q2兩個(gè)繁縷RIP基因并獲得異源表達(dá)，為繁縷抗病毒藥效物質(zhì)的分離純化和闡明提供了關(guān)鍵信息。主要研究結(jié)果如下：
　　 1繁縷活性蛋白分離純化、結(jié)構(gòu)及生物活性研究
　　 1.1繁縷活性蛋白分離純化
　　 以抗病毒(HSV-2)活性為導(dǎo)向分離指標(biāo)，采用50％-85％飽和度硫酸銨鹽析、弱陽(yáng)離子交換柱層析、葡聚糖凝膠柱層

3、析及強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析技術(shù)，從繁縷中分離得到一種抗病毒活性蛋白。SDS-PAGE、FPLC、MALDI-TOFMS顯示該蛋白達(dá)到色譜純以上，精確分子量為35.157kD;PAS染色結(jié)果表明該蛋白是糖蛋白；IEF-PAGE電泳結(jié)果表明為堿性蛋白，等電點(diǎn)9.3＜pI＜9.6.
　　 1.2繁縷活性蛋白鑒定
　　 對(duì)分離得到的活性蛋白，應(yīng)用MALDI-TOF MS進(jìn)行肽指紋圖譜分析，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索未能發(fā)現(xiàn)與之匹配的數(shù)據(jù)。應(yīng)用ESI

4、-Q-TOF2 MS解析了活性蛋白的4個(gè)胰酶水解肽段的氨基酸序列，分別為GFEVIDAAK(Fr1)、GPSFAVQLR(Fr2)、AFSTNKGLAPGLLR(Fr3)和MGNTGVLTGERNDR(Fr4).數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)結(jié)果顯示獲得的序列為蛋白新序列.多重序列比對(duì)結(jié)果表明其中Fr1和Fr4肽段與植物POD的部分氨基酸保守序列同源性較高。鑒定該蛋白是一種新的天然植物蛋白，命名為SAP(Stellaria Antiviral Pro

5、tein)。
　　 1.3繁縷活性蛋白生物活性研究
　　 實(shí)驗(yàn)表明SAP具有抗病毒、抗腫瘤活性。體外抗病毒實(shí)驗(yàn)顯示SAP可體外抑制HSV-2對(duì)細(xì)胞的感染，IC50達(dá)到0.37μM,CC50大于40μM。其在HSV-2感染初期作用效果最顯著，作用機(jī)制與直接使病毒失活有關(guān)。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示SAP有較強(qiáng)的抗人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60和人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo生長(zhǎng)活性，IC50分別為9.09μM和12.32μM，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞生

6、長(zhǎng)無(wú)明顯作用，CC50大于40μM,具有顯著地選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用.
　　 SAP具有較強(qiáng)的RNAN-糖苷酶活性和DNA超螺旋裂解活性。SAP對(duì)核糖體RNA和超螺旋DNA的這種切割作用具有不可修復(fù)性，可以稱之為DNA（RNA）糖苷酶/脫嘌呤裂解酶，這種酶活性也許是SAP抗病毒、抗腫瘤的主要作用機(jī)制之一.體外POD活性實(shí)驗(yàn)表明SAP還具有較強(qiáng)的POD活性，酶活力大小為36.6Umin－1μg－1，Km值為0.01mol/L.

7、
　　 2繁縷核糖體失活蛋白（RIP）基因的克隆及其原核表達(dá)研究
　　 2.1繁縷RIP基因克隆及序列分析
　　 采用同源克隆的方法，獲得繁縷RIP基因保守區(qū)片段，結(jié)合RACE技術(shù)獲得5’和3’非翻譯區(qū)序列，將相關(guān)序列拼接，獲得了2條繁縷RIP基因Q1(FJ860049)和Q2(FJ860050)的cDNA全長(zhǎng)。Q1與Q2的開(kāi)放閱讀框（ORF）分別為858bp,765bp，其同源性為95.5％.Q1、Q2有390

8、個(gè)堿基與同科其他植物RIP基因完全相同，且堿基的分布具有一定的規(guī)律性，但與不同科屬植物RIP同源性較低.Q1、Q2和以DNA為模板獲得的繁縷RIP基因Q(FJ860051)進(jìn)行分析比較，證實(shí)繁縷RIP基因無(wú)內(nèi)含子。
　　 Q1和Q2編碼的繁縷RIP分別命名為Stellarin1和Stellarin2.二者的理論分子量分別為31.0kD和27.6kD,pI分別為9.40和9.54，都包含由23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。其理化特征均與Ⅰ

9、型RIP和SAP相似，但與后者的同源性較低。序列分析發(fā)現(xiàn)，Stellarin1和Stellarin2與已知RIP產(chǎn)生抗病毒活性的特征區(qū)域同源性很高，相應(yīng)保守區(qū)域完全相同，表明繁縷RIP具備抗病毒能力，預(yù)示繁縷存在多種抗病毒活性蛋白.
　　 2.2繁縷RIP基因原核表達(dá)
　　 將Q1、Q2連接到載體，獲得重組質(zhì)粒pET29a-Q1和pET29a-Q2，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)和BL21(DE3)ply