TIP30基因敲除誘發(fā)小鼠乳腺癌的相關(guān)研究.pdf

1、乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，全世界每年約有138萬婦女患乳腺癌，約45萬人死于乳腺癌[1,2]。在全球，乳腺癌發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢(shì);其中歐美國(guó)家近25年來乳腺癌死亡率有所下降，但在亞太及非洲很多國(guó)家乳腺癌死亡率仍在上升中[1,2]。近年來，盡管乳腺癌的診斷和治療均有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但關(guān)于乳腺癌的發(fā)病機(jī)理目前仍未明確。雌激素受體(Estrogenreceptor，ER)在乳腺的發(fā)育及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中均起了重要的作用。在人類乳腺

2、癌中，ER陽(yáng)性乳腺癌就高達(dá)60-70％。臨床上已將ER檢測(cè)作為評(píng)估患者預(yù)后和選擇治療方案的指標(biāo)。盡管ER陽(yáng)性乳腺癌的治療效果及預(yù)后較好，但目前對(duì)于這種最常見類型乳腺癌發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)仍有限。在本研究中，我們應(yīng)用TIP30基因敲除小鼠模型探討了該亞型乳腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　 TIP30基因，又稱CC3或Htatip2，是1998年肖華等在研究人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的體

3、外轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)一種分子量為30kD的Tat(Transactivatoroftranscription)結(jié)合蛋白(Tatinteractiveprotein)[3]。研究發(fā)現(xiàn)TIP30在多種腫瘤組織中的表達(dá)異常，如肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌等[4-9]，提示TIP30與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。Hua等研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因敲除可以自發(fā)形成多種腫瘤[9,10]。這些研究提示TIP30是一種腫瘤抑制基因。TIP30具有多種

4、功能，可以作為一種轉(zhuǎn)錄共分子參與凋亡及增殖相關(guān)基因的調(diào)控[11,12]，它還可以作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[13]。在乳腺和乳腺癌細(xì)胞中，TIP30還可以抑制ERα調(diào)節(jié)的c-myc轉(zhuǎn)錄[12]。近來研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌和肺癌中，TIP30可以調(diào)控EGFR細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和下游信號(hào)通路的活性[14,15]。
　　 我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因敲除可以誘發(fā)小鼠乳腺導(dǎo)管增生，而且隨著年齡的增長(zhǎng)，增生程度越明顯。同時(shí)，我們?cè)谟蠩r

5、bb2(Neu)轉(zhuǎn)基因背景的FVB小鼠中敲除TIP30，發(fā)現(xiàn)TIP30基因缺失可以加速小鼠乳腺癌發(fā)生，而且所有自發(fā)性乳腺癌均為ER陽(yáng)性乳腺癌。而在本研究中，我們排除了Neu基因的影響，發(fā)現(xiàn)在Balb/c背景的小鼠中敲除TIP30便能誘發(fā)小鼠乳腺癌。為了進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，我們對(duì)該小鼠模型EGFR下游信號(hào)分子進(jìn)行了初步的探討，并在人乳腺癌細(xì)胞株中研究了TIP30基因在EGFR降解中的調(diào)節(jié)作用。
　　 由于乳腺癌是異質(zhì)性相當(dāng)大的

6、腫瘤，其病理和分子學(xué)特點(diǎn)具有多樣性復(fù)雜性。近年來，乳腺腫瘤形成的干細(xì)胞模型為乳腺癌的異質(zhì)性及不同乳腺癌亞型的起源提供了解釋[16,17]。這一模型認(rèn)為不同乳腺腫瘤亞型是起源于不同的乳腺干細(xì)胞或祖細(xì)胞，而特異性的突變可使這些細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而使其自我更新失控及異常分化，最終誘發(fā)腫瘤發(fā)生。此外，在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，不同基因?qū)Σ煌瑏喨喝橄偕掀ぜ?xì)胞影響不同，而且會(huì)影響乳腺癌亞型的發(fā)生。比如，乳腺癌病毒(mmTv)-Wnt-1小鼠可以擴(kuò)增乳腺

7、干細(xì)胞亞群，同時(shí)形成luminal型和basal型乳腺癌[18-20]。而mmTv-Neu小鼠可以促進(jìn)luminal細(xì)胞群擴(kuò)增，僅產(chǎn)生luminal型且ER/PR陰性乳腺癌[21,22]。因此通過在小鼠動(dòng)物模型中研究特定基因?qū)θ橄偌?xì)胞亞群及腫瘤類型形成的影響將有助于增強(qiáng)對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)理的了解。此外，我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因敲除后可以使Neu轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌的表型由ER-/PR-陰性轉(zhuǎn)變?yōu)镋R+/PR-，提示TIP30基因不只是

8、個(gè)抑癌基因，它在乳腺癌表型的決定上也可能起了一定的作用。因此，本研究在干細(xì)胞層面探討了TIP30基因缺失對(duì)乳腺干細(xì)胞/祖細(xì)胞亞群及其分化傾向方面可能存在的作用，并為該動(dòng)物模型形成的限制性ER陽(yáng)性乳腺癌提供了一定的解釋。
　　 第一部分TIP30基因敲除誘發(fā)小鼠乳腺癌及活化EGFR下游通路的研究
　　 一、材料與方法
　　 1.通過雜交的方法，獲得TIP30基因敲除的Balb/c小鼠，連續(xù)傳代7代以上，獲得Balb

9、/c純合背景的TIP30基因敲除小鼠。
　　 2.所有Balb/c小鼠飼養(yǎng)至滿78周時(shí)，二氧化碳吸入處死，詳細(xì)檢查小鼠大腦、乳腺、胸腔臟器、腹腔臟器、生殖器官等肉眼可見部位有無腫瘤和其它疾病出現(xiàn)。常規(guī)組織固定、石蠟包埋并切片。部分組織丟入液氮速凍，最后于-80℃保存。
　　 3.應(yīng)用蘇木精-伊紅(H&E)染色法檢測(cè)組織器官及乳腺腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。切片由兩位病理學(xué)家閱片并分析。計(jì)算發(fā)生乳腺癌的小鼠百分比。
　　 4

10、.應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測(cè)乳腺組織或腫瘤組織CK8、αSMA、pAkt、pERK表達(dá)。
　　 5.應(yīng)用免疫熒光染色(IF)法檢測(cè)乳腺腫瘤組織ER及PR表達(dá)情況。
　　 6.應(yīng)用shRNA-TIP30及shRNA-CON質(zhì)粒包裝慢病毒顆粒，感染MCF-7細(xì)胞，puromycin篩選，并經(jīng)Western-blot檢測(cè)驗(yàn)證基因干擾效果。
　　 7.應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)經(jīng)EGF誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)

11、EGF與EGFR、EGFR與EEA1及TIP30與EEA1的共表達(dá)情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組的腫瘤發(fā)生率比較采用x2檢驗(yàn);兩組及多組間均數(shù)比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單向方差分析;兩組不同時(shí)間點(diǎn)均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析;多重比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett檢驗(yàn)。P≤0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。
　　 二、結(jié)果
　　

12、1.TIP30基因敲除可導(dǎo)致Balb/c小鼠自發(fā)性乳腺腫瘤出現(xiàn)
　　 經(jīng)過18個(gè)月的密切觀察，共有47只雌性未孕小鼠完成實(shí)驗(yàn)觀察。28只Tip30-/-小鼠中有8只發(fā)現(xiàn)乳腺自發(fā)腫瘤(發(fā)病率28.6％)，而19只Tip30+/+小鼠中均未發(fā)現(xiàn)有乳腺自發(fā)腫瘤(0％)。Tip30-/-小鼠乳腺自發(fā)腫瘤的發(fā)生率顯著高于Tip30+/+小鼠，x2=6.269，P=0.012。
　　 2.TIP30基因敲除致Balb/c小鼠乳腺腫瘤

13、均為ER/PR陽(yáng)性luminal型
　　 我們應(yīng)用luminal標(biāo)志CK8和basal標(biāo)志αSMA對(duì)乳腺腫瘤組織行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果提示，所有腫瘤組織CK8染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，而αSMA染色陰性，提示Tip30-/-小鼠自發(fā)乳腺腫瘤均為luminal型。進(jìn)一步的ER及PR免疫熒光染色，結(jié)果顯示所有腫瘤均為ER陽(yáng)性和PR陽(yáng)性乳腺癌。提示Tip30-/-小鼠自發(fā)乳腺腫瘤為ER/PR陽(yáng)性luminal型腫瘤。
　　 3.TIP3

14、0基因敲除可致EGFR下游MAPK及PI3K信號(hào)通路的活化
　　 我們應(yīng)用了免疫組化對(duì)乳腺及腫瘤組織pErk1/2及pAkt進(jìn)行檢測(cè)。Tip30-/-小鼠乳腺上皮細(xì)胞pErk1/2及pAkt陽(yáng)性率分別為27.83±8.46％和30.83±6.65％(n=5)，顯著高于Tip30+/+小鼠乳腺上皮細(xì)胞的12.58±5.87％和14.94±5.77％(n=5)，P值分別0.02和0.011。而Tip30-/-小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞pErk

15、1/2及pAkt陽(yáng)性率分別為51.68±8.57％和56.08±8.44％(n=5)，則顯著高于Tip30-/-小鼠乳腺上皮細(xì)胞的27.83±8.46％和30.83±6.65％，P分別為0.002和0.001。
　　 4.TIP30表達(dá)下調(diào)可延遲EGF誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞中EGFR的降解。
　　 4.1TIP30-SH1、TIP30-SH2乳腺細(xì)胞株MCF-7的TIP30蛋白明顯抑制
　　 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7通

16、過shRNA干擾后，以內(nèi)參β-actin為標(biāo)準(zhǔn)，TIP30-SH1和TIP30-SH2細(xì)胞TIP30蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為13.12±3.95％和11.54±2.68％(n=3)，顯著低于shRNA-CON細(xì)胞的84.3±8.66％(n=3)，P均＜0.001。TIP30-SH1及TIP30-SH2細(xì)胞TIP30蛋白表達(dá)分別下降達(dá)71.18％及72.76％，這些結(jié)果提示基因轉(zhuǎn)染后TIP30-SH1、TIP30-SH2細(xì)胞TIP30表達(dá)被顯

17、著抑制。
　　 4.2TIP30在乳腺癌細(xì)胞中可促進(jìn)EGF誘導(dǎo)的EGFR降解
　　 TIP30-SH組細(xì)胞在經(jīng)EGF作用后，10min和1h時(shí)EGF及EGFR的熒光強(qiáng)度與shRNA-CON組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4h時(shí)兩組EGF及EGFR熒光強(qiáng)度均顯著下降，其中TIP30-SH組細(xì)胞EGF及EGFR的熒光強(qiáng)度分別為1.19±0.18和1.33±0.13，顯著性高于shRNA-CON組0.68±0.08和0.76±0.10

18、，t值分別為4.563和6.132，P值分別為0.01和0.004，以上結(jié)果提示細(xì)胞的TIP30基因干擾后，EGF及EGFR降解速度減慢，于4h時(shí)仍有大量EGF及EGFR未降解。
　　 同時(shí)檢測(cè)EGF及EGFR共定位情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞EGF及EGFR在10min時(shí)Pearson's共定位值最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。于4h時(shí)，TIP30-SH組共定位值為35.07±5.33，顯著性高于shRNA-CON組的10.76±2.28，

19、t=7.270，P=0.002。提示相對(duì)于shRNA-CON組，TIP30-SH組細(xì)胞EGF及EGFR推遲分離降解，有更多的EGF/EGFR結(jié)合物存在于細(xì)胞內(nèi)。
　　 4.3TIP30基因下調(diào)可延長(zhǎng)EGFR在早期內(nèi)涵體內(nèi)聚集時(shí)間
　　 TIP30-SH及shRNA-CON細(xì)胞在經(jīng)EGF處理2小時(shí)后，shRNA-CON細(xì)胞EGFR綠色熒光與EEA1紅色熒光Pearson's共定位值為27.31±9.12％，顯著性低于TIP

20、30-SH細(xì)胞組的56.39±14.08％，t=3.003，P=0.04。提示TIP30基因干擾后，EGFR的推遲從早期內(nèi)涵體分離。
　　 4.4TIP30可聚集于早期內(nèi)涵體內(nèi)，參與EGFR代謝
　　 EGF處理shRNA-CON細(xì)胞10分鐘后，激光共聚焦顯微鏡下TIP30綠色熒光與EEA1紅色熒光明顯重疊，提示TIP30在早期進(jìn)入內(nèi)涵體參與EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 三、結(jié)論
　　 1.TIP30基因敲除的B

21、alb/c小鼠可自發(fā)乳腺癌。
　　 2.TIP30基因敲除的Balb/c小鼠所發(fā)生乳腺癌均為ER/PR陽(yáng)性luminal型腫瘤。
　　 3.TIP30基因敲除可以激活乳腺及乳腺癌中EGFR下游MAPK及PI3K信號(hào)通路分子。
　　 4.TIP30基因抑制可干擾EGFR自內(nèi)涵體分離，抑制EGF誘導(dǎo)的EGFR降解，導(dǎo)致EGFR下游信號(hào)分子持續(xù)激活。
　　 第二部分TIP30基因敲除誘導(dǎo)小鼠乳腺干/祖細(xì)胞擴(kuò)增并

22、影響其分化傾向的研究
　　 一、材料與方法
　　 1.通過雜交的方法，獲得TIP30基因敲除的Balb/c及Neu+/+FVB小鼠，連續(xù)傳代7代以上，獲得各種系純合背景的TIP30基因敲除小鼠。
　　 2.解剖收集5-6月齡小鼠乳腺組織并剪碎，用無血清膠原酶溶液消化，獲得乳腺上皮細(xì)胞懸液。
　　 3.應(yīng)用細(xì)胞懸浮球形培養(yǎng)方法檢測(cè)各基因表型小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳腺小球形成能力。顯微鏡下拍照并計(jì)算乳腺小球數(shù)量及大

23、小。
　　 4.應(yīng)用體外克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)各基因表型小鼠乳腺上皮細(xì)胞克隆形成能力。顯微鏡下拍照并計(jì)算克隆形成數(shù)及大小。
　　 5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析各基因表型小鼠乳腺上皮細(xì)胞CD24HighCD49flow(MRUs)及CD24HighCD49flow(Ma-CFCs)百分比例，并分析CD24HighCD49flow群中Sca(1)+及Sca(1)-比例。
　　 6.應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選出Balb/c小鼠各基因表型乳

24、腺上皮細(xì)胞中祖細(xì)胞群CD24HighCD49flow并行體外克隆形成試驗(yàn)，收集克隆并行ER/PR免疫熒光染色。
　　 7.應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)Balb/c小鼠各基因表型乳腺組織ER/PR表達(dá)情況。
　　 8.應(yīng)用qPCR檢測(cè)Balb/c小鼠各基因表型乳腺組織中與乳腺干/祖細(xì)胞分化相關(guān)的因子表達(dá)情況。
　　 9.應(yīng)用Western-blot檢測(cè)Balb/c各基因表型小鼠乳腺組織FOXA1及RANKL表達(dá)。
　　

25、 10.應(yīng)用shRNA-FOXA1及shRNA-CON質(zhì)粒包裝慢病毒顆粒，感染乳腺細(xì)胞，puromycin篩選，并經(jīng)Western-blot檢測(cè)驗(yàn)證基因干擾效果后，行體外克隆形成試驗(yàn)并行克隆ER免疫熒光染色。
　　 11.統(tǒng)計(jì)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組及多組間均數(shù)比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單向方差分析;多重比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett檢驗(yàn)。P(＜)0.05

26、(雙側(cè))表示差異有顯著性。
　　 二、結(jié)果
　　 1.TIP30基因敲除可促進(jìn)乳腺干/祖細(xì)胞群擴(kuò)增
　　 1.1TIP30基因敲除可增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞體外乳腺小球形成能力
　　 小鼠乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)體外懸浮無血清培養(yǎng)9天后，Tip30-/-Balb/c小鼠每5000個(gè)乳腺上皮細(xì)胞形成乳腺小球數(shù)目為31.75±5.85個(gè)，顯著性多于Tip30+/+Balb/c小鼠的19.75±4.79個(gè)，t=3.174，P=0

27、.019。而Tip30-/-Neu+/+FVB及Tip30+/+Neu+/+FVB小鼠的乳腺小球形成數(shù)目分別為31.25±5.56個(gè)/5000細(xì)胞及17.5±4.04個(gè)/5000細(xì)胞，具有顯著性差異(t=4.001，P=0.007)。
　　 同時(shí)檢測(cè)乳腺小球直徑，Tip30-/-Balb/c小鼠乳腺小球直徑為156.80±29.28μm，顯著性大于Tip30+/+Balb/c小鼠的97.59±20.66μm，t=3.305，P=

28、0.016;而在Tip30-/-Neu+/+FVB小鼠乳腺小球的直徑為128.29±27.83μm，雖然高于Tip30+/+Neu++FVB小鼠的105.53±14.19μm，但無顯著性差異(t=1.457，P=0.195)。
　　 1.2TIP30基因敲除可增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞體外克隆形成能力
　　 將從小鼠乳腺組織獲得的乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液按照2000細(xì)胞每孔種植于鋪有Matrigel孔板中，培養(yǎng)10天。Tip30/B

29、alb/c小鼠的體外克隆形成數(shù)目為33.33±5.13，顯著性多于Tip30+/+Balb/c小鼠的19.00±6.00，t=3.144，P=0.035。而Tip30-/-Neu+/+FVB小鼠的體外克隆形成數(shù)目亦顯著性高于Tip30+/+Neu+/+FVB小鼠(33.00±5.29vs.18.00±4.36，t值3.709，P值為0.019)。
　　 在檢測(cè)克隆大小時(shí)發(fā)現(xiàn)，Tip30-/-Neu+/+FVB小鼠的克隆直徑雖然大

30、于Tip30+/+Neu+/+FVB小鼠(126.68±25.42μmvs.97.41±13.13μm)，但無顯著差異(t=1.772，P=0.151)。而Balb/C背景的Tip30基因敲除小鼠的克隆大小顯著性高于Tip30+/+Balb/C小鼠(137.9±16.17μmvs.90.79±22.89μm)，t值為2.914，P值為0.044。
　　 1.3TIP30基因敲除可擴(kuò)增小鼠乳腺干細(xì)胞
　　 MRUs即乳腺再

31、繁殖單位(CD24HighCD49flow)，該細(xì)胞群富集乳腺干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，Tip30基因敲除的Balb/C小鼠的MRUs百分比為2.83±0.51％，顯著性高于Tip30+/+Balb/C小鼠的1.27±0.51％，t值為3.739，P值為0.02。在有Neu轉(zhuǎn)基因背景的FVB小鼠中亦得到相似結(jié)果，Tip30-/-Neu+/+FVB小鼠MRUs的百分比為6.73±0.85％，顯著性高于Tip30+/+Neu+/+FV

32、B小鼠的1.30±0.60％,t=9.042,P=0.001。
　　 1.4TIP30基因敲除可擴(kuò)增小鼠乳腺祖細(xì)胞
　　 Ma-CFCs即乳腺克隆形成細(xì)胞(CD24HighCD49flow)，該細(xì)胞群富集乳腺祖細(xì)胞。同樣應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Tip30-/-Balb/C小鼠的Ma-CFCs百分比(3.23±0.49％)顯著性高于Tip30+/+Balb/C小鼠(0.87±0.38％)，t值為6.592，P值為0.003。T

33、ip30-/-Neu+/+FVB小鼠的Ma-CFCs百分比為3.07±0.76％，顯著性高于Tip30+/+Neu+/+FVB小鼠的1.43±0.31％，t=3.465，P=0.026。
　　 2.TIP30基因敲除可導(dǎo)致乳腺ER+祖細(xì)胞比例增多
　　 在Balb/c小鼠中，應(yīng)用Sca(1)對(duì)乳腺祖細(xì)胞再劃分為CD24HighCD49flowSca(1)+及CD24HighCD49flowSca(1)-兩個(gè)亞群，分別代表

34、ER+祖細(xì)胞及ER-祖細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:Tip30-/-Balb/c小鼠乳腺ER+祖細(xì)胞占祖細(xì)胞的30.67±2.45％，顯著性高于Tip30+/+Balb/c小鼠的17.73±1.76％，t=7.415，P=0.002;而Tip30-/-Neu+/+FVB小鼠ER+祖細(xì)胞占祖細(xì)胞的23.80±5.27％，顯著性高于Tip30+/+Neu+/+FVB的13.57±2.70％,t=2.994,P=0.04。
　　 3.

35、TIP30基因敲除可導(dǎo)致乳腺祖細(xì)胞傾向ER+細(xì)胞分化
　　 我們運(yùn)用流式細(xì)胞儀分選出乳腺祖細(xì)胞亞群(CD24HighCD49flow)，使其在Matrigel上分化生長(zhǎng)形成克隆，并進(jìn)行ER/PR免疫熒光染色。結(jié)果如圖及表示，Tip30-/-Balb/c小鼠的乳腺祖細(xì)胞形成的克隆中ER陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占45.35±7.80％，顯著性高于Tip30+/+Balb/c小鼠的31.77±6.38％，t=2.698，P=0.036。而Tip30

36、-/-Balb/c和Tip30+/+Balb/c小鼠的乳腺祖細(xì)胞形成的克隆中PR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為38.70±8.45％及33.76±6.33％，無顯著性差異(t=0.936，P=0.385)。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TIP30基因?qū)R+細(xì)胞分化的影響，我們對(duì)Balb/c小鼠乳腺組織行ER/PR免疫熒光染色，結(jié)果示Tip30-/-Balb/c和Tip30+/+Balb/c小鼠乳腺組織ER陽(yáng)性細(xì)胞分別占21.13±3.59％和13.

37、00±3.716％，t=3.15，P=0.020，有顯著性差異;而PR陽(yáng)性細(xì)胞分別占18.53±2.83％和16.77±3.16％，t=0.832，P=0.437，無顯著性差異。
　　 4.TIP30基因敲除可上調(diào)乳腺組織FOXA1表達(dá)
　　 我們?cè)趍RNA水平檢測(cè)了與乳腺干/祖細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路分子Notch、Hedgehog、Wnt及GATA3、FOXA1的表達(dá)情況，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果僅有FOXA1在TIP

38、30基因敲除的乳腺組織中高表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)值為3.05±0.90，顯著性高于p30+/+Balb/c小鼠的1.00±0.17，t=3.879，P=0.018。進(jìn)一步我們對(duì)其蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，Tip30-/-Balb/c小鼠乳腺組織FOXA1蛋白表達(dá)相對(duì)值為66.24±5.93％，亦顯著性高于Tip30+/+Balb/c小鼠的40.27±8.18％，t=4.454，P=0.011。提示TIP30基因的缺失可能使FOXA1的表達(dá)的上調(diào)

39、，從而誘導(dǎo)更多的ER陽(yáng)性細(xì)胞分化。
　　 5.下調(diào)乳腺細(xì)胞FOXA1表達(dá)可減少ER陽(yáng)性細(xì)胞分化
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TIP30基因敲除導(dǎo)致的ER陽(yáng)性細(xì)胞分化增多是否通過升高FOXA1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。我們從Tip30-/-Balb/c小鼠分離出乳腺上皮細(xì)胞，應(yīng)用FOXA1-SH1、FOXA1-SH2及shRNA-CON基因干擾后，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)驗(yàn)證FOXA1表達(dá)明顯示受抑制后，行體外克隆形成試驗(yàn)，并進(jìn)行ER免

40、疫熒光染色。結(jié)果示FOXA1-SH1、FOXA1-SH2組形成的克隆中ER陽(yáng)性細(xì)胞分別占31.00±2.85％及29.52±5.67％，顯著性低于shRNA-CON組的39.40±6.16％，P值分別為0.042及0.018。該結(jié)果提示，TIP30基因敲除后，通過(至少部分通過)升高FOXA1的表達(dá)來促進(jìn)乳腺祖細(xì)胞傾向ER陽(yáng)性細(xì)胞分化。
　　 6.TIP30基因敲除可以上調(diào)乳腺組織RANKL的表達(dá)
　　 我們?cè)谶M(jìn)一步研究

41、TIP30基因敲除小鼠乳腺干/祖細(xì)胞擴(kuò)增可能的原因時(shí)發(fā)現(xiàn)，TIP30基因敲除可以使小鼠乳腺組織RANKL表達(dá)增高，其相對(duì)表達(dá)值為16.91±1.13，顯著性高于野生型小鼠的7.94±4.47，t=3.370，P=0.028。提示TIP30基因敲除小鼠可能通過依靠增多的性激素受體細(xì)胞增強(qiáng)分泌RANKL，并通過旁分泌的方式作用于乳腺干/祖細(xì)胞，從而使其擴(kuò)增。
　　 三、結(jié)論
　　 1.TIP30基因敲除可以擴(kuò)增小鼠乳腺干/祖