卡那霉素和速尿導致豚鼠耳聾及其基因治療的探索性研究.pdf

1、感音神經性聾嚴重影響著人類的健康和生存質量，但目前尚無有效治療方法，一般認為，毛細胞再生是治療感音神經性聾的關鍵。近幾年對聽覺和聽力損失分子機理的理解，結合基因和分子治療內耳疾病的進步給臨床治療感音神經性聾提供了可行性，使基因治療有望成為治療內耳疾病的新技術。本研究擬行藥物性聾動物模型建立及其評價，并進行內耳Hath1基因導入誘導毛細胞再生，探索基因治療的可能性。分為以下三個部分。 第一部分：卡那霉素和速尿聯合用藥后豚鼠聽功能損

2、害 試驗豚鼠肌肉注射硫酸卡那霉素(500mg/kg)2小時后給予速尿(50mg/kg)靜脈注射，分別于用藥3天、7天及2月行聽覺腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response ABR)檢測，用藥3天行聽神經復合動作電位(compound action potential CAP)及耳蝸微音電位(cochlear microphonicCM)檢測，對試驗組和對照組豚鼠耳蝸聽功能結果進行統計學分析，結果發(fā)現豚鼠

3、耳毒性藥物敏感性不同，僅約半數豚鼠出現聽功能嚴重受損(ABR閾值＞95dBSPL)；用藥3天組各頻率短純音誘發(fā)的ABR閾值(2kHz，4kHz，8kHz，16kHz)明顯比對照組提高(p＜0.01)，而用藥3天組、用藥7天組和用藥2月組各頻率ABR閾值比較無差別(p＞0.05)；發(fā)現部分豚鼠用藥后CAP閾值輕度提高，但是CM明顯異常；用藥2月后嚴重致聾豚鼠聽力無恢復。 結論：卡那霉素和速尿聯合用藥可導致約半數豚鼠聽功能嚴重受損并

4、且用藥2月致聾豚鼠聽力無恢復?？敲顾睾退倌蚵摵嫌盟幨墙⑺幬镄悦@動物模型的一種快速且較可靠的方法。 第二部分：卡那霉素和速尿聯合用藥后豚鼠耳蝸毛細胞和聽神經損害觀察 對藥物損傷致聾豚鼠(ABR閾值＞95dBSPL)進行耳蝸切片鋪片、掃描電鏡及毛細胞死亡模式觀察，發(fā)現耳蝸毛細胞嚴重受損，以外毛細胞(OHCs)缺失為主，耳蝸第一、二回毛細胞缺失比第三、四回嚴重，嚴重致聾的豚鼠內毛細胞(IHCs)也廣泛缺失，但是切片顯示柯替

5、氏器的支持細胞存在；聯合用藥1周開始豚鼠的聽神經出現損害，與OHCs連接的神經纖維損害為主；隨著用藥時間延長，聽神經損害加重，而且耳蝸第一、二回聽神經損害比第三、四回嚴重；掃描電鏡發(fā)現耳蝸第一、二回IHCs和OHCs靜纖毛散亂、融合，毛細胞全部被瘢痕替代。發(fā)現KM/速尿給藥6小時豚鼠耳蝸出現OHCs核固縮和核腫脹，給藥9小時豚鼠耳蝸OHCs核腫脹數目增多，OHCs核固縮和核腫脹多見于耳蝸第一回，豚鼠耳蝸各回IHCs顯示正常毛細胞特征。給

6、藥6小時和給藥9小時豚鼠耳蝸用TUNEL技術檢測凋亡DNA片段，沒有觀察到陽性著色細胞。 結論：卡那霉素和速尿聯合用藥后不僅有毛細胞廣泛缺失，而且伴隨聽神經損害，隨著用藥時間延長，聽神經損害加重；毛細胞死亡模式有凋亡和壞死兩種方式。 第三部分：卡那霉素和速尿致聾豚鼠的Hath1基因治療 對致聾豚鼠(ABR閾值＞95dBSPL)進行基因治療探索性研究。致聾豚鼠經完整圓窗膜途徑導入促進毛細胞再生的Hath1基因，結果

7、發(fā)現用藥4周、用藥8周ABR閾值與用藥前相比沒有差別；與導入前相比較，所有空白對照組和導入人工淋巴液的豚鼠導入耳沒有發(fā)現毛細胞增多或再生，10只導入Ad.Hath1-EGFP豚鼠中只有1只導入耳耳蝸第三回毛細胞明顯比未導入耳增多。致聾豚鼠經腹側入路暴露聽泡，去除部分聽泡骨暴露鼓階，于鼓階近圓窗處打孔微量注射器導入Hath1基因，結果發(fā)現非導入耳ABR閾值導入前后無改變，導入耳ABR閾值與自身非導入耳比較無明顯差別，導入耳組ABR閾值與對