豬GPR120基因的轉錄調控機制及miR-25對肌肉細胞能量代謝的抑制作用研究.pdf

1、能量代謝是動物生長、生產、繁育等重要生命活動的基礎;同時與人類代謝綜合癥等息息相關。因此，對能量代謝調控進行研究不僅有助于提高動物生產經濟效益同時對于改善人類健康也具有重大的意義。在本課題組前期的研究中，通過對大白豬的組織表達譜分析，發(fā)現GPR120是差異表達基因。GPR120基因參與能量平衡的多個生理過程，調節(jié)全身性能量和營養(yǎng)代謝平衡。本研究擬對GPR120基因進行研究，分析研究GPR120基因的轉錄調控機制，揭示GPR120基因在能

2、量代謝調控過程的作用。本研究還基于胚胎期大白豬和通城豬的背最長肌組織的Solexa測序獲得miR-25，通過分析miR-25序列，預測靶基因并進行功能分析驗證;同時對miR-25的轉錄調控機制進行初步研究，探尋轉錄因子調節(jié)miR-25轉錄的分子機制。主要研究結果如下:
　　1.豬GPR120基因的轉錄調控機制研究
　　基于預測的啟動子區(qū)域CpG島分布情況構建GPR120基因啟動子區(qū)域的缺失片段雙熒光素酶載體，雙熒光結果顯示缺

3、失片段P5(-323/+165)是GPR120基因核心啟動子區(qū)域。使用TFSEARCH ver.1.3網站預測GPR120基因核心啟動子區(qū)域中有與能量代謝相關的轉錄因子C/EBPβ的結合位點(TGTCG);而且在人、小鼠和豬三個物種，GPR120啟動子區(qū)域中的C/EBPβ結合位點高度保守。通過定點突變實驗證明轉錄因子C/EBPβ結合位點的突變顯著地抑制了GPR120啟動子的轉錄活性;而且通過ChIP實驗表明，在體內環(huán)境中，轉錄因子C/E

4、BPβ可以與GPR120基因核心啟動子結合。超表達C/EBPβ顯著性促進了GPR120和PPARγ基因的表達;而干涉C/EBPβ的表達則顯著性抑制了GPR120基因的表達。此外，我們的實驗結果還表明，高能飼喂(HFD-feeding)能夠促進小鼠脂肪組織中GPR120，C/EBPβ和PPAR-γ2基因的表達，并且能夠增強轉錄因子C/EBPβ與GPR120基因啟動子區(qū)域的結合能力。
　　2.miR-25在肌肉細胞能量代謝中的作用

5、r>　　對C2Cl2成肌細胞進行成肌誘導分化，檢測結果表明:小鼠miR-25-3p的表達量在C2Cl2成肌細胞分化過程中呈現先下調后上調的變化趨勢。在轉染miR-25-3pmimics的實驗組中，檢測結果表明肌肉細胞能量代謝的標志基因PI3K、Map2k4的表達水平顯著下降。運用多種miRNA靶基因預測生物信息學網站預測miR-25-3p靶基因，發(fā)現Akt1基因的3'UTR區(qū)域有miR-25-3p的結合位點，而且序列比對分析發(fā)現在哺乳動

6、物中Akt1基因的miR-25靶位點序列具有高度的保守性。雙熒光結果顯示，miR-25-3p顯著地抑制了Akt1-3'UTR的熒光活性，說明miR-25-3p能夠識別Akt1基因的3'UTR上的miR-25-3p靶位點并與其發(fā)生特異性結合。超表達miR-25-3p可以顯著性下調Akt1和PI3K基因的mRNA表達水平;與此同時，miR-25-3p的超表達導致了Akt1和PI3K蛋白表達水平的下降。
　　總之，miR-25-3p可以

7、靶向基因Akt1，并抑制Akt1在mRNA和蛋白水平上的表達，進而可能影響PI3K/Akt信號通路的活化，調節(jié)肌肉細胞的能量代謝過程。
　　3.小鼠miR-25轉錄調控機制的研究
　　本研究中，我們克隆了小鼠miR-25-3p的5'端上游區(qū)域2034bp序列并構建miR-25-3p啟動子區(qū)域缺失片段熒光載體，熒光活性檢測結果發(fā)現，缺失片段miR-25-3p-P9（-119/+144）是miR-25的核心啟動子區(qū)域。使用生物信

8、息學網站對miR-25核心啟動子的轉錄調控元件進行預測分析，發(fā)現一個潛在的轉錄因子AP-2α結合位點。定點突變實驗發(fā)現轉錄因子AP-2α結合位點的突變顯著地抑制了miR-25啟動子的轉錄活性。通過ChIP-Q-PCR實驗證明:在體內環(huán)境中，轉錄因子AP-2α可以與miR-25啟動子發(fā)生特異性地結合。而且通過ChIP-Q-PCR實驗證明與C2Cl2細胞分化第8d相比，轉錄因子AP-2α與miR-25啟動子在C2Cl2細胞分化第0d時結合能

9、力更強。超表達AP-2α可以顯著促進miR-25啟動子的活性;而且超表達AP-2α可以顯著性提高miR-25的mRNA表達量，同時也可以下調miR-25靶基因Akt1的mRNA和蛋白表達水平;與此一致，干涉AP-2α的表達顯著性抑制了miR-25的mRNA表達量，同時也提高了基因Akt1的mRNA和蛋白表達量。
　　上述實驗結果證明AP-2α在miR-25轉錄過程中有著重要的調控作用，并且能夠識別miR-25核心啟動子區(qū)域的轉錄因