PRV誘導(dǎo)IL-10及抑制應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)感染豬引起偽狂犬病，導(dǎo)致新生仔豬出現(xiàn)致死性腦炎，育肥豬呼吸障礙，母豬繁殖障礙等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成極為不利的影響，PRV具有潛伏感染的特性，嚴(yán)重影響豬場(chǎng)凈化豬偽狂犬病的進(jìn)程。IL-10是一種重要的多效免疫調(diào)節(jié)因子，病毒潛伏感染誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-10可阻止病毒潛伏感染的細(xì)胞發(fā)生死亡，有助于儲(chǔ)存潛伏感染病毒的基因組。
　　應(yīng)激顆粒（SGs）作為哺乳動(dòng)物翻譯系統(tǒng)關(guān)閉的結(jié)果，有利于細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界環(huán)境壓力（比如熱休克，氧化

2、性應(yīng)激，局部缺血或者病毒感染）。不同病毒對(duì)SGs的影響不同，有些病毒為了借助SGs募集的蛋白完成自身的復(fù)制，會(huì)誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞內(nèi)形成SGs，而有些病毒為了抵抗宿主翻譯休止對(duì)自身蛋白質(zhì)和基因組的復(fù)制的不利影響，則會(huì)破壞感染細(xì)胞內(nèi)SGs的累積。
　　本文通過體外研究，探討PRV感染對(duì)IL-10及應(yīng)激顆粒的影響，內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.PRV感染顯著誘導(dǎo)IL-10的啟動(dòng)子，mRNA及分泌水平
　　通過雙熒光素酶系統(tǒng)及RT-

3、PCR方法，動(dòng)態(tài)分析PRV感染PK-15細(xì)胞對(duì)IL-10啟動(dòng)子及mRNA的影響，同時(shí)，在PAM細(xì)胞上，利用ELISA試劑盒檢測(cè)PRV對(duì)IL-10分泌的影響。我們發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細(xì)胞6h以上，可極顯著激活I(lǐng)L-10的啟動(dòng)子活性，且與感染時(shí)間有關(guān)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，激活倍數(shù)相應(yīng)的增加，但是PRV誘導(dǎo)IL-10啟動(dòng)子與感染劑量無關(guān);而PRV感染PK-15細(xì)胞12h可誘導(dǎo)IL-10 mRNA水平，且與感染劑量有關(guān);PRV感染PAM細(xì)胞

4、12h誘導(dǎo)其蛋白水平，18 h達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。紫外線滅活的PRV不影響PRV誘導(dǎo)IL-10的啟動(dòng)子，mRNA及蛋白水平，表明PRV誘導(dǎo)IL-10與病毒復(fù)制密切相關(guān)。
　　2.IL-10啟動(dòng)子低甲基化修飾參與PRV誘導(dǎo)IL-10過程
　　通過BSP測(cè)序及超表達(dá)poDNMTs，分析IL-10啟動(dòng)子甲基化水平與PRV誘導(dǎo)IL-10的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細(xì)胞，可顯著減低IL-10啟動(dòng)子的甲基化水平，且超表達(dá)poDN

5、MT3a或者poDNMT3b抑制PRV誘導(dǎo)IL-10的啟動(dòng)子水平，表明IL-10啟動(dòng)子的低甲基化參與PRV誘導(dǎo)IL-10的過程。
　　3.PRV感染不誘導(dǎo)SGs累積
　　通過IFA技術(shù)，動(dòng)態(tài)分析PRV感染HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)SGs的情況，結(jié)果顯示PRV感染不同時(shí)間均不誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)SGs，且與感染劑量無關(guān)。為了排除細(xì)胞特異性的原因，在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，得到相同的結(jié)果，即PRV感染不能誘導(dǎo)SGs的累積。
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6、.PRV感染破壞陽性刺激物誘導(dǎo)SGs的累積
　　采用IFA技術(shù)，動(dòng)態(tài)分析PRV感染對(duì)陽性刺激物Arsenite（依賴eIF2α磷酸化誘導(dǎo)SGs）及Hippuristanol（不依賴eIF2α磷酸化誘導(dǎo)SGs）誘導(dǎo)SGs的影響，結(jié)果顯示PRV感染阻礙這2種刺激物誘導(dǎo)SGs的累積，表明PRV阻礙SGs累積不依賴于eIF2α磷酸化。利用western-blot技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)PRV感染的HeLa細(xì)胞內(nèi)，TIA-1蛋白水平有所下降，再用Ar