蘋果潛隱性病毒脫除及RT-PCR技術(shù)研究.pdf

1、蘋果病毒具有危害性強(qiáng)、傳播擴(kuò)散快和難以治愈等特點(diǎn)。目前蘋果病毒的危害在我國(guó)蘋果生產(chǎn)上呈現(xiàn)上升勢(shì)頭，無(wú)病毒苗木的培育迫在眉睫。本研究以SH40蘋果繼代組培苗(組培苗叢芽)為試材，用熱處理+暗培養(yǎng)+莖尖培養(yǎng)的方法對(duì)蘋果的三種潛隱性病毒進(jìn)行了脫除，研究了在38/32℃的變溫?zé)崽幚硐掳蹬囵B(yǎng)對(duì)試材的生長(zhǎng)量、存活苗的高度、增殖系數(shù)、存活率及脫毒率的影響，優(yōu)化了脫毒體系，提高了脫毒效率。采用優(yōu)化的RT-PCR方法對(duì)蘋果三種潛隱性病毒進(jìn)行檢測(cè)，不但降低

2、了成本且提高了效率。本試驗(yàn)做以下處理:①將室溫下培養(yǎng)7d的組培苗叢芽置于GXZ型智能光照培養(yǎng)箱進(jìn)行光培養(yǎng)，起點(diǎn)溫度26/25℃，每天升高1℃，升至38/32℃后變溫培養(yǎng)30d。②將室溫下暗培養(yǎng)7d的組培苗叢芽置于GXZ型智能光照培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，起點(diǎn)溫度26/25℃，每天升高1℃，升至38/32℃后變溫培養(yǎng)30d。⑧將室溫下暗培養(yǎng)2d的組培苗叢芽置于GXZ型智能光照培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，起點(diǎn)溫度26/25℃，每天升高1℃，升至38/32℃后

3、變溫培養(yǎng)30d。④將室溫下暗培養(yǎng)2d的組培苗叢芽直接置于38/32℃下變溫暗培養(yǎng)30d。⑤將室溫下暗培養(yǎng)7d的組培苗直接置于38/32℃下變溫暗培養(yǎng)30d。結(jié)果如下: 1.熱處理+暗培養(yǎng)的存活率、存活苗的高度及增殖系數(shù)均優(yōu)于熱處理+光培養(yǎng)的處理。分別為:對(duì)照(光培養(yǎng))處理1:46％，2.1cm，2.1；處理2:65％，3.1cm，4.7:處理3:83％，3.0cm，5.6；處理4:81％，2.65cm，7.2；處理5:70％，3

4、.7em，6.4。 2.預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件(光/暗培養(yǎng))對(duì)試材的影響，以處理4效果最好。然后取2mm的莖尖進(jìn)行繼代培養(yǎng)30d后，即可用于RT-PCR方法檢測(cè)。該方法不但使得莖尖培養(yǎng)取材由傳統(tǒng)的0.2mm增加到2mm，降低了顯微操作的難度，而且大幅度提高了脫除病毒的效率。ACLSV、ASGV和ASPV的脫毒率分別為100％、93.3％、100％。 3.采用RNAplant試劑盒提取蘋果組培苗總RNA，利用DNaseⅠ除R

5、NA中的DNA，進(jìn)而采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。優(yōu)化了RT-PCR體系，ACLSV的最佳參數(shù)為:Mgz2+:1.5mmol/L，TaqE的用量為2U，退火溫度為58℃；ASGV的最佳參數(shù)為:Mg2+:2mmol/L，TaqE的用量為1.5U，退火溫度為55℃；ASPV的最佳參數(shù)為:Mg2+:2mmol/L，TaqE的用量為1U，退火溫度為55℃，RNA模板的用量均為1.0μl，PCR選用體系A(chǔ)CLSV:20μl；ASGV、ASPV；2