棉鈴蟲中腸Cry1A結合蛋白分離、鑒定及其與抗性的關系.pdf

1、轉基因棉花的大規(guī)模種植對控制棉花害蟲的危害發(fā)揮了重要作用，但害蟲長期處于轉基因作物Bt毒蛋白的高壓選擇下，害蟲對Bt作物抗性問題將不容忽視。昆蟲對Bt毒素的抗性機制是復雜和多樣的，但中腸結合位點的改變是最主要的一種機制。棉鈴蟲中已知的受體有氨肽酶N和鈣粘蛋白。保存在本實驗室的高抗Cry1A蛋白的棉鈴蟲品系經前人研究未發(fā)現該品系存在鈣粘蛋白基因的缺失、失活，比較抗、感品系棉鈴蟲的鈣粘蛋白、APN序列，只發(fā)現少量氨基酸的變異，因此該棉鈴蟲品

2、系對Cry1A產生抗性很可能與受體蛋白表達水平變化相關或存在其它的受體蛋白。 本文首先比較了兩種雙向電泳系統(tǒng)以及幾種BBMV提取方法對雙向電泳的影響，建立了棉鈴蟲中腸Bt結合蛋白蛋白質組學的研究方法，利用蛋白質組學的方法分離和分析了棉鈴蟲中腸Cry1A毒素的結合蛋白，比較了抗、感品系棉鈴蟲中Cry1Ac結合蛋白的變化，探討該棉鈴蟲品系對Bt毒蛋白產生抗性的可能機制。并比較了抗、感品系棉鈴蟲中與不同Bt毒蛋白作用的結合蛋白的差異。

3、在國內首次開展了利用蛋白質組學研究棉鈴蟲的中腸Bt結合蛋白及其與抗性的關系。主要結果如下： 1、方法的建立：比較ISO-DALT和IPG-DALT兩種雙向電泳系統(tǒng)，發(fā)現這兩種系統(tǒng)都可以用于棉鈴蟲Cry1Ac結合蛋白的分離，ISO-DALT對結合蛋白的分離效果雖比IPG-DALT更好，尤其對高分子量蛋白的分離明顯優(yōu)于IPG-DALT法，但由于上樣量少，因此對后續(xù)的質譜分析非常不利；IPG-DALT雖較昂貴但有利于進行后續(xù)試驗，因此

4、本文選用IPG-DALT系統(tǒng)進行雙向電泳。比較已報道的這三種BBMV提取方法：Wolfersberger法、English-Readdy法、Abdul-Rauf法，結果顯示這三種方法對分離Cry1Ac結合蛋白的種類沒有影響，但這三種方法獲得的蛋白量不一樣結果?？偨Y三種方法的優(yōu)點，建立了一種新的綜合BBMV提取方法，獲得了高量的蛋白，通過雙向電泳和結合試驗證明該方法適合雙向電泳Cry1A結合蛋白研究。 2、利用雙向電泳結合West

5、ern雜交以及生物質譜的方法，研究了棉鈴蟲中腸Cry1Ac結合蛋白，首次鑒定得到棉鈴蟲中腸四種新的Cry1Ac結合蛋白：V-ATPase亞基B、熱激蛋白、肌動蛋白以及一種未知的新蛋白。肌動蛋白和V-ATPase亞基A己報道為煙芽夜蛾中Cry1Ac結合蛋白，熱激蛋白和未知新蛋白為首次報道的昆蟲中腸Cry1Ac結合蛋白。 3、用蛋白質組學的方法比較了抗、感棉鈴蟲中腸結合蛋白的數量和表達量，結果發(fā)現結合蛋白種類無差異，但其中一種新的結

6、合蛋白在抗性品系中表達量至少下降了6.49倍。前人的研究說明，碘標記結合試驗證明結合位點或受體數目減少是該抗性品系對Cry1A毒蛋白產生抗性的主要原因。結合前人研究和本文結果，本文新結合蛋白表達量嚴重降低可能是該抗性品系產生抗性的原因之一。 4、初步比較Cry1Ac、Cry1Ab和Cry1Ah作用于敏感品系和抗性品系的結合蛋白。結果發(fā)現無論是抗性品系和敏感品系Cry1Ab的結合都是最少的，在敏感品系中，Cry1Ab未結合肌動蛋白