DA品系大鼠胚胎干細胞系的建立及多能性檢測.pdf

1、胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)是一類來源于哺乳動物囊胚階段內細胞團的多能性細胞。自從1981年人類首次成功建立了第一株小鼠胚胎干細胞以來，由于其能夠在體外無限擴增，并且具有發(fā)育的多能性，所以利用胚胎干細胞在基因功能的研究，基因修飾，以及細胞治療和臨床應用等都有廣闊的應用前景。大鼠是第一種用于科學研究的哺乳動物。由于大鼠體型適中，并且與小鼠相比其生理調節(jié)和藥理反應等方面與人類的相關性更近，因此在過去的15

2、0年間，大鼠被作為動物模型被廣泛地應用于生理學、移植醫(yī)學、免疫學、遺傳學、神經(jīng)科學、癌癥和老化等領域的研究，尤其是某些特殊疾病，例如神經(jīng)疾病和心血管疾病的研究更具有優(yōu)勢。然而，在小鼠胚胎干細胞建立后的二十幾年中，人們一直沒有成功的建立起真正的大鼠胚胎干細胞。這就使得大鼠在基因敲除動物模型領域的研究遠遠落后于小鼠。直到2008年，華人科學家應其龍等利用N2827并添加抑制因子(3i：CHIR99021，PD184352，SU5402或2i

3、：CHIR99021，PD0325901)的無血清培養(yǎng)體系首次分離得到了具有種系嵌合能力的真正的大鼠ESCs。隨后又報道了通過大鼠胚胎干細胞進行基因打靶(Gene targeting)，并成功獲得TP53基因敲除大鼠。從而解決了限制大鼠轉基因模型研究的瓶頸。
　　 本研究使用無血清培養(yǎng)液N2827并添加抑制因子PD0325901，CHIR99021以及Lif的培養(yǎng)體系，從DA品系大鼠囊胚中分離得到了大鼠胚胎干細胞。經(jīng)鑒定其具有典

4、型的胚胎干細胞形態(tài)，呈克隆狀，貼壁或懸浮生長；堿性磷酸酶染色結果呈陽性，且具有正常的二倍體細胞核型；經(jīng)過PCR，免疫熒光染色和Western blot等方法檢測，我們所建立的DA大鼠胚胎干細胞表達Oct4，Nanog，Sox2，SSEA-1，F(xiàn)GF4，Rex1和Eras等細胞多能性因子；在體外長期傳代培養(yǎng)仍能夠維持自我更新的狀態(tài)。
　　 DA大鼠胚胎干細胞在無Lif的條件下可以在體外分化成擬胚體(Embryoid bodys，E

5、Bs)；將大鼠胚胎干細胞注射到F344品系的二倍體囊胚中可以得到嵌合體大鼠；研究發(fā)現(xiàn)囊胚作為受體相比四細胞胚胎可以得到更高的二倍體嵌合效率；大部分嵌合體大鼠可以存活至成年，并將其與SD品系大鼠交配后能夠得到種系嵌合的子代大鼠。因此，上述研究證明了我們所建立的DA大鼠胚胎干細胞是具有種系嵌合能力的、真正的大鼠胚胎干細胞。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)一種新的大鼠胚胎干細胞培養(yǎng)體系(N2827-4i)，即在經(jīng)典的無血清N2827-2i培養(yǎng)液的基

6、礎上添加了另外兩種抑制因子Y-27632和A-83-01。結果表明N2827-4i培養(yǎng)體系有利于維持大鼠胚胎干細胞體外長期傳代培養(yǎng)，并證明了使用該體系可以顯著提高胚胎干細胞的體外增殖速度。研究進一步證明了N2827-4i培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的大鼠胚胎干細胞具有產生嵌合體大鼠和種系嵌合的能力，尤其是相比傳統(tǒng)N2827-2i培養(yǎng)體系可以提高較高代次的大鼠胚胎干細胞產生嵌合體及種系嵌合效率。
　　 利用大鼠胚胎干細胞做為供體細胞進行大鼠核移

7、植的研究，結果表明體外培養(yǎng)體系不能支持大鼠核移植胚胎的發(fā)育，而利用體內移植的方法可以發(fā)育并得到大鼠核移植囊胚。從這些核移植囊胚中可以分離得到核移植胚胎干細胞(ntES)，經(jīng)鑒定其具有典型的大鼠胚胎干細胞形態(tài)，并具有一定的多能性。進一步研究的結果表明，大鼠胚胎干細胞核移植胚胎在體內具有發(fā)育到E11.5天的能力，而沒有獲得發(fā)育到期的大鼠胎兒。
　　 綜上所述，本研究所建立的DA品系大鼠胚胎干細胞系，是具有種系嵌合能力的大鼠胚胎干細胞