Nob1在耳蝸毛細胞損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　感音神經性耳聾是導致言語交流障礙的一種常見疾病,嚴重影響患者的生活質量。盡管目前臨床上治療感音神經性耳聾的策略有很多,但治療效果不佳。明確耳蝸細胞損傷的分子調控網絡,尋找有效防治耳聾的目的基因,阻止誘導毛細胞凋亡的信號分子,成為未來耳聾基因治療新的方向。本研究團隊首次發(fā)現(xiàn)Nob1在哺乳動物受損耳蝸細胞中高表達,但這一表達變化的具體規(guī)律、機制及在感音神經聾中所起的作用還不清楚。
　　目的：
　　本研究主要探尋

2、Nob1在出生后大鼠耳蝸內的表達規(guī)律,擬利用基因轉染技術改變Nob1在耳蝸毛細胞中的表達,借助體內外實驗研究Nob1對耳蝸毛細胞生物學行為的影響及與耳蝸毛細胞損傷之間的關系,以期證明Nob1基因是一個新的候選耳聾基因,為深入理解耳蝸毛細胞損傷的分子事件,探討新的治療方法奠定基礎。
　　方法：
　　通過免疫組織熒光技術、Weatern-blot及實時定量PCR技術,觀察Nob1在出生后大鼠耳蝸內的表達規(guī)律。構建含 Nob1基因

3、的慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV)以及腺病毒過表達載體(Ad5-Nob1-mCMV-EGFP),將病毒載體轉染至體外培養(yǎng)的HK-2細胞系,上調以及下調Nob1基因表達,探尋Nob1與凋亡之間的關系。在體外行離體耳蝸器官培養(yǎng),利用順鉑誘導離體耳蝸毛細胞損傷后,觀察 Nob1在毛細胞中的表達情況,并轉染慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV),用RT-PCR和Western blot鑒定病毒的轉染及Nob1表達情

4、況。最后在大鼠體內進一步驗證Nob1在耳蝸毛細胞損傷中的作用,從耳蝸中階入路分別將Nob1-RNAi-GFP-LV干擾載體、慢病毒空載體和人工內淋巴液注射入三組大鼠耳蝸,待RNAi發(fā)揮作用后,利用順鉑誘導大鼠耳蝸損傷,分別用ABR評估各組病毒載體注射前后大鼠聽力變化;通過基底膜鋪片觀察毛細胞的形態(tài)變化,并采用全耳蝸毛細胞定量分析系統(tǒng)行耳蝸毛細胞計數(shù),Western-blot及實時定量PCR方法進一步明確相關分子的表達變化。
　　結

5、果：
　　Nob1在大鼠耳蝸毛細胞及螺旋神經元中有表達,在細胞發(fā)育增殖分化高峰期比較弱,出生后隨著時間的增加而逐漸增強。當毛細胞分化,內外毛細胞形成,大、小上皮嵴開始分化形成各種支持細胞時,Nob1表達較新生時期明顯增強。
　　我們成功構建含Nob1基因的慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV)以及腺病毒過表達載體(Ad5-Nob1-mCMV-EGFP),在體外培養(yǎng)HK-2細胞系中成功上調及下調Nob1基因,通過流

6、式細胞儀檢測到上調Nob1表達后的凋亡細胞數(shù)明顯高于下調Nob1基因表達組。
　　在體外培養(yǎng)的耳蝸器官組織中,通過低濃度順鉑成功誘導耳蝸毛細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)Nob1在部分細胞核固縮的凋亡毛細胞細胞核中表達,出現(xiàn)核轉位現(xiàn)象。隨著順鉑作用時間的增加,毛細胞的損傷逐漸加重,Nob1表達也逐漸增高,Western-blot結果與免疫組織熒光結果一致。在體外培養(yǎng)的耳蝸器官組織中,慢病毒干擾載體無法轉染至耳蝸毛細胞,只能轉染至螺旋神經元。通過耳蝸

7、中階注射,將慢病毒干擾載體成功轉染至耳蝸外毛細胞、血管紋邊緣細胞及螺旋韌帶處。外淋巴內可見少量慢病毒顆粒分布,而內毛細胞處及螺旋神經元處未見病毒分布。最后,在體內慢病毒干擾可下調Nob1基因表達,再給予順鉑誘導耳蝸毛細胞損傷后,與對照組相比,下調Nob1基因組的大鼠耳蝸聽力閾值降低,耳蝸毛細胞損傷程度也降低。
　　結論：
　　Nob1可能通過凋亡信號分子通路參與了耳蝸器官的形成,在順鉑誘導的耳蝸毛細胞損傷中,Nob1可能參與