基于Endoglin靶大鼠膠質瘤的磁共振分子影像學實驗研究.pdf

1、目的：合成制備基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定脂質體磁共振分子探針并評價其理化性質；各種對比劑大鼠膠質瘤磁共振分子影像學研究，驗證探針特異性顯示膠質瘤形態(tài)及邊界的有效性。
　　材料與方法：一)空間穩(wěn)定脂質體的制備：(1)脂質體膜材料，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇(CHOL)、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、釓-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺(Gd-DTPA-BSA)按36:36:3:25摩爾比例溶于氯仿

2、甲醇混合溶劑(2:1容積)中，經(jīng)40℃旋轉蒸發(fā)，60℃水化，高壓均質儀擠壓過膜，制備包載順磁性物質(Gd)的空間穩(wěn)定脂質體(Gd-SLs)；(2)評價脂質體的粒徑、穩(wěn)定性、釓含量、磁共振馳豫率及體外MR成像作用等性質。二)基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定免疫脂質體及預定位脂質體分子探針的制備：(1)Gd-SLs成膜過程中，加入膜材料吡啶二硫丙?；?聚乙二醇(2000)-二硬脂酰乙醇胺(PDP-PEG(2000)-DSPE)，制備表面修飾

3、結合PDP基團脂質體(PDP-SLs)，PDP-SLs脂質體經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)還原，得表面結合游離巰基的脂質體(HS-SLs)：(2)CD105單克隆抗體(CD105～MAb)與丁二酰亞胺4-(對-馬來酰亞胺-苯基)-丁酸酯(SMPB)反應制備馬來酰亞胺苯基丁酰基單克隆抗體(MPB-MAb)：(3)將HS-SLs與MPB-MAb反應獲得的表面連接抗體的空間穩(wěn)定脂質體(MAb-SLs)；(4)生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羥基琥珀

4、酰亞胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)與CD105～MAb反應可得生物素化單克隆抗體(Bio-MAb)；(5)鏈霉親和素結合空間穩(wěn)定脂質體(SAv-SLs)的制備過程與MAb-SLs基本相同，將HS-SLs與馬來酰亞胺苯基丁酰基鏈霉親和素(MPB-SAv)作用，可得SAv-SLs；(6)測定免疫脂質體抗體蛋白密度及抗體結合率，各種脂質體探針透射電鏡觀察形態(tài)。三)大鼠膠質瘤新生血管內皮細胞Endoglin靶的MR分子成像：(1

5、)大鼠C6膠質瘤細胞培養(yǎng)及膠質瘤動物模型的建立；(2)25只模型動物隨機分為A～E共5組，每組5只，分別尾靜脈注射釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)、空白脂質體(Gd-SLs)、同種型對照IgG脂質體(IgG-SLs)、結合Endoglin單克隆抗體的免疫脂質體探針(MAb-SLs)行MR成像，兩步法預定位成像大鼠預先給予生物素化單克隆抗體(Bio-MAb)后再給予鏈霉親和素脂質體探針(SAv-SLs)進行成像：(3)比較各組大鼠MRT1加權

6、增強圖像腫瘤強化表現(xiàn)的差異，分析各組動脈血管、正常腦組織及肌組織、腫瘤組織時間.信號增強特點；(4)比較各組間腫瘤強化程度及強化范圍差異、比較組內腫瘤中央部及周邊部強化差異；(5)比較各組間腫瘤強化形態(tài)的差異；(6)大鼠膠質瘤CD105免疫組織化學染色腫瘤中央部及周邊部新生血管計數(shù)，比較兩者差異。
　　結果：一)所制備之釓結合空間穩(wěn)定脂質體(Gd-SLs)經(jīng)高壓均質儀過膜后粒徑控制于117.4±31.8nm；脂質體Gd載藥率達87

7、％～100％；常溫下(26℃)Gd-SLs磁共振馳豫率為Gd-DTPA的1.16倍，37℃為1.25倍；體外MR成像顯示Gd-SLs與Gd-DTPA兩對比劑MRT1加權成像作用接近。二)空間穩(wěn)定脂質體結合單克隆抗體后粒徑由116.1nm±33.9nm增加至129.9nm±40.9nm，于4℃保存7、14、42天，平均粒徑及分布變化較??；將Bio-MAb與SAv-SLs混合后，平均粒徑顯著增大(267nm±142.8nm)，分布增寬；免疫

8、脂質體抗體結合率為52～67％，相應抗體/磷脂比例約為47～60μg/μmol；透射電鏡顯示，脂質體為均勻大小囊泡樣結構，將Bio-MAb與SAv-SLs混合后，SAv-SLs有相互聚集作用。三)荷瘤大鼠MR成像(1)動脈增強表現(xiàn)：注射Gd-DTPA后，動脈血液快速明顯強化，即刻達峰值，2小時基本消退，時間-信號曲線呈快進-快出類型：B～E組大鼠注射相應分子探針后，血管強化表現(xiàn)接近，早期快速明顯強化，強化峰值于20～60min出現(xiàn)，之后

9、強化信號緩慢下降，于48小時恢復至增強前水平，其時間-信號曲線表現(xiàn)為快進-平臺-緩出類型。(2)腫瘤強化表現(xiàn)：注射Gd-DTPA后，腫瘤迅速強化達峰值，20min強化即有減退，2小時強化信號約為峰值強度30％，24小時完全退出；注射Gd-SLs及IgG-SLs，腫瘤早期強化不明顯，60～120min達峰值呈輕度強化，48小時強化信號為峰值強度42～58％；注射MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像，腫瘤周邊及中央信號迅

10、速增高，于8小時達峰值，后緩慢下降，注射MAb-SLs后腫瘤中央周邊強化程度相仿，而兩步法成像周邊強化明顯高于中央部(P=0.032)。(3)腫瘤強化形態(tài)分析顯示，注射Gd-DTPA整個腫瘤不均勻強化，Gd-SLs及IgG-SLs組以腫瘤邊緣點狀強化為主，MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像腫瘤增強以邊緣環(huán)形強化為主。免疫組織化學染色顯示，CD105陽性微血管主要沿腫瘤周邊分布。
　　結論：(1)順磁性空間穩(wěn)定

11、脂質體能有效提高磁共振分子探針體內成像信號，制備方法簡單，實驗操作可控性好，在一定溫度范圍內性質穩(wěn)定，具有較高的磁共振弛豫作用，是理想的MR分子影像學對比劑載體。(2)免疫脂質體結合抗體方法簡單，效果確切可靠，體外相關實驗能夠驗證生物素-親和素介導的兩步法成像的有效性。(3)大鼠膠質瘤MR分子成像，臨床用Gd-DTPA腫瘤強化周邊及中央強度無差異，非特異性脂質體探針腫瘤強化程度低，腫瘤邊界強化形態(tài)不完整，因此均不能用于腫瘤邊界顯示。MA