基于Endoglin靶大鼠膠質瘤的磁共振分子影像學實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:合成制備基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定脂質體磁共振分子探針并評價其理化性質;各種對比劑大鼠膠質瘤磁共振分子影像學研究,驗證探針特異性顯示膠質瘤形態(tài)及邊界的有效性。
  材料與方法:一)空間穩(wěn)定脂質體的制備:(1)脂質體膜材料,二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇(CHOL)、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、釓-二乙三胺五醋酸-二硬脂酰胺(Gd-DTPA-BSA)按36:36:3:25摩爾比例溶于氯仿

2、甲醇混合溶劑(2:1容積)中,經(jīng)40℃旋轉蒸發(fā),60℃水化,高壓均質儀擠壓過膜,制備包載順磁性物質(Gd)的空間穩(wěn)定脂質體(Gd-SLs);(2)評價脂質體的粒徑、穩(wěn)定性、釓含量、磁共振馳豫率及體外MR成像作用等性質。二)基于Endoglin靶的空間穩(wěn)定免疫脂質體及預定位脂質體分子探針的制備:(1)Gd-SLs成膜過程中,加入膜材料吡啶二硫丙?;?聚乙二醇(2000)-二硬脂酰乙醇胺(PDP-PEG(2000)-DSPE),制備表面修飾

3、結合PDP基團脂質體(PDP-SLs),PDP-SLs脂質體經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)還原,得表面結合游離巰基的脂質體(HS-SLs):(2)CD105單克隆抗體(CD105~MAb)與丁二酰亞胺4-(對-馬來酰亞胺-苯基)-丁酸酯(SMPB)反應制備馬來酰亞胺苯基丁酰基單克隆抗體(MPB-MAb):(3)將HS-SLs與MPB-MAb反應獲得的表面連接抗體的空間穩(wěn)定脂質體(MAb-SLs);(4)生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羥基琥珀

4、酰亞胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)與CD105~MAb反應可得生物素化單克隆抗體(Bio-MAb);(5)鏈霉親和素結合空間穩(wěn)定脂質體(SAv-SLs)的制備過程與MAb-SLs基本相同,將HS-SLs與馬來酰亞胺苯基丁酰基鏈霉親和素(MPB-SAv)作用,可得SAv-SLs;(6)測定免疫脂質體抗體蛋白密度及抗體結合率,各種脂質體探針透射電鏡觀察形態(tài)。三)大鼠膠質瘤新生血管內皮細胞Endoglin靶的MR分子成像:(1

5、)大鼠C6膠質瘤細胞培養(yǎng)及膠質瘤動物模型的建立;(2)25只模型動物隨機分為A~E共5組,每組5只,分別尾靜脈注射釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)、空白脂質體(Gd-SLs)、同種型對照IgG脂質體(IgG-SLs)、結合Endoglin單克隆抗體的免疫脂質體探針(MAb-SLs)行MR成像,兩步法預定位成像大鼠預先給予生物素化單克隆抗體(Bio-MAb)后再給予鏈霉親和素脂質體探針(SAv-SLs)進行成像:(3)比較各組大鼠MRT1加權

6、增強圖像腫瘤強化表現(xiàn)的差異,分析各組動脈血管、正常腦組織及肌組織、腫瘤組織時間.信號增強特點;(4)比較各組間腫瘤強化程度及強化范圍差異、比較組內腫瘤中央部及周邊部強化差異;(5)比較各組間腫瘤強化形態(tài)的差異;(6)大鼠膠質瘤CD105免疫組織化學染色腫瘤中央部及周邊部新生血管計數(shù),比較兩者差異。
  結果:一)所制備之釓結合空間穩(wěn)定脂質體(Gd-SLs)經(jīng)高壓均質儀過膜后粒徑控制于117.4±31.8nm;脂質體Gd載藥率達87

7、%~100%;常溫下(26℃)Gd-SLs磁共振馳豫率為Gd-DTPA的1.16倍,37℃為1.25倍;體外MR成像顯示Gd-SLs與Gd-DTPA兩對比劑MRT1加權成像作用接近。二)空間穩(wěn)定脂質體結合單克隆抗體后粒徑由116.1nm±33.9nm增加至129.9nm±40.9nm,于4℃保存7、14、42天,平均粒徑及分布變化較??;將Bio-MAb與SAv-SLs混合后,平均粒徑顯著增大(267nm±142.8nm),分布增寬;免疫

8、脂質體抗體結合率為52~67%,相應抗體/磷脂比例約為47~60μg/μmol;透射電鏡顯示,脂質體為均勻大小囊泡樣結構,將Bio-MAb與SAv-SLs混合后,SAv-SLs有相互聚集作用。三)荷瘤大鼠MR成像(1)動脈增強表現(xiàn):注射Gd-DTPA后,動脈血液快速明顯強化,即刻達峰值,2小時基本消退,時間-信號曲線呈快進-快出類型:B~E組大鼠注射相應分子探針后,血管強化表現(xiàn)接近,早期快速明顯強化,強化峰值于20~60min出現(xiàn),之后

9、強化信號緩慢下降,于48小時恢復至增強前水平,其時間-信號曲線表現(xiàn)為快進-平臺-緩出類型。(2)腫瘤強化表現(xiàn):注射Gd-DTPA后,腫瘤迅速強化達峰值,20min強化即有減退,2小時強化信號約為峰值強度30%,24小時完全退出;注射Gd-SLs及IgG-SLs,腫瘤早期強化不明顯,60~120min達峰值呈輕度強化,48小時強化信號為峰值強度42~58%;注射MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像,腫瘤周邊及中央信號迅

10、速增高,于8小時達峰值,后緩慢下降,注射MAb-SLs后腫瘤中央周邊強化程度相仿,而兩步法成像周邊強化明顯高于中央部(P=0.032)。(3)腫瘤強化形態(tài)分析顯示,注射Gd-DTPA整個腫瘤不均勻強化,Gd-SLs及IgG-SLs組以腫瘤邊緣點狀強化為主,MAb-SLs及Bio-MAb/SAv-SLs兩步法成像腫瘤增強以邊緣環(huán)形強化為主。免疫組織化學染色顯示,CD105陽性微血管主要沿腫瘤周邊分布。
  結論:(1)順磁性空間穩(wěn)定

11、脂質體能有效提高磁共振分子探針體內成像信號,制備方法簡單,實驗操作可控性好,在一定溫度范圍內性質穩(wěn)定,具有較高的磁共振弛豫作用,是理想的MR分子影像學對比劑載體。(2)免疫脂質體結合抗體方法簡單,效果確切可靠,體外相關實驗能夠驗證生物素-親和素介導的兩步法成像的有效性。(3)大鼠膠質瘤MR分子成像,臨床用Gd-DTPA腫瘤強化周邊及中央強度無差異,非特異性脂質體探針腫瘤強化程度低,腫瘤邊界強化形態(tài)不完整,因此均不能用于腫瘤邊界顯示。MA

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