穩(wěn)定表達雞ST3GAL I的MDCK細胞系的建立.pdf

1、流感病毒通過其表面的血凝素(HA)與細胞表面唾液酸寡糖受體結合侵染宿主細胞。禽流感病毒傾向識別α-2,3連接型受體(NeuAcα-2,3-Gal)，而人流感病毒傾向識別α-2,6連接型受體(NeuAcα-2.6-Gal)。流感病毒不同毒株間在受體識別傾向性及親和能力上存在顯著差異，進而影響其對宿主細胞的感染、增殖和擴散能力。 H5N1和H9N2是兩種嚴重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的禽流感病毒亞型，部分毒株在其自然進化過程中獲得了跨宿主感染的

2、能力，具有極為重要的公共衛(wèi)生意義。雞胚培養(yǎng)系統是分離增殖H5N1、H9N2禽流感病毒最常用的系統，但有可能改變分離株已經形成的感染和復制特性。MDCK細胞表面同時存在α-2,6和α-2,3連接型受體，成為研究流感病毒的主要細胞。目前H5N1和H9N2亞型流行株仍保持典型的NeuAcα-2,3-Gal受體結合傾向性，部分毒株雖具備在MDCK等哺乳動物細胞上復制增殖的能力，但低受體豐度造成病毒滴度低，蝕斑形成能力弱，給進一步深入研究乃至疫苗

3、和抗病毒藥物研制造成極大困難。提高MDCK工程細胞系表面受體豐度，有可能改進禽流感病毒分離株的生長滴度及蝕斑形成能力。 為此，本研究克隆了雞β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶I(ST3GALI)表達框架，構建了高效真核表達質粒，轉染MDCK細胞，通過G418抗性及綠色熒光蛋白標記雙重篩選，獲得一株工程細胞系克隆MDCK-ST3GALI。以特異性識別α-2,3連接型受體的高麗槐黃柏甙凝集素(MAA)為抗體，經流式細胞儀檢測分析顯

4、示，MDCK-ST3GALI細胞系中2,3連接型受體含量較親代MDCK細胞顯著提高。選取2株H5N1禽流感病毒分離株、5株H9N2禽流感病毒分離株進行了TCID50測定和蝕斑形成能力分析，結果顯示，7株禽流感病毒在MDCK-ST3GALI細胞上測得的生長滴度比在MDCK細胞上高；與MDCK細胞相比，在MDCK-ST3GALI細胞上形成的蝕斑數量更多、面積更大、形態(tài)更為清晰。 本研究結果表明，穩(wěn)定表達ST3GALI的MDCK細胞系

5、MDCK-ST3GALI通過增強ST3GALI催化唾液酸與乳糖以α-2,3形式連接的效力，提高了細胞表面NeuAcα-2,3-Gal受體豐度，顯著改進了部分H5N1和H9N2亞型分離株在MDCK細胞系上的感染敏感性和復制能力。MDCK-ST3GALI細胞系不僅為禽流感病毒α-2,3連接型受體傾向性提供了重要的研究工具，對于禽流感病毒受體結合特性變異株監(jiān)測、抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定乃至大規(guī)模細胞培養(yǎng)疫苗生產應用，也具有廣泛應