特異性殺傷EB病毒相關腫瘤的病毒基因治療的研究.pdf

1、該研究利用EBNA1與oriP的關系,以EBNA1作為靶基因,將oriP增強子片段與啟動子結合,插入到腺病毒復制關鍵基因E1區(qū)上游,從而使腺病毒復制只限在EBNA1陽性細胞中進行,而在EBNA1陰性細胞中不復制,以達到特異性殺傷EB病毒相關腫瘤的目的,為EB病毒相關腫瘤的治療提供新的方法.本研究包括以下三個方面:1.EBNA1陽性上皮細胞模型的建立:將1200bp的EBNA1基因片段插入真核細胞表達載體pcDNA3中,獲得質粒pcDNA

2、3/EBNA1,用脂質體介導將pcDNA3/EBNA1質粒轉入鼻咽癌CNE<,2>細胞和人宮頸癌Hela細胞,通過G418進行陽性克隆的篩選,PCR、RT-PCR和Western Blot進行鑒定,結果表明,兩種轉基因細胞株能夠表達EBNA1,為研究EB病毒相關腫瘤提供了良好的細胞模型.2.EB病毒復制起始區(qū)(oriP)對轉錄增強作用的研究:oriP是EB病毒染色體上一個1.7kb大小的區(qū)域,它維持了EB病毒質粒在EBNA1陽性細胞中的

3、復制和穩(wěn)定存在,為了在EBNA1陽性細胞中篩選出oriP對轉錄最具增強作用的功能片段,利用PCR、酶切等技術獲得oriP不同的組合片段,插入到帶有CAT報告基因的載體pCAT3-Promoter中,構建出一系列攜帶oriP不同功能片段的質粒,并瞬時轉染EB病毒原型細胞株B95-8,培養(yǎng)48小時后,通過比較CAT的表達水平,得出在EB病毒基因組中位于7,394 bp~8,041 bp之間的FR片段對轉錄的增強作用最好,相當于oriP全序列