調節(jié)性T細胞在中樞神經系統(tǒng)損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　免疫炎癥反應是創(chuàng)傷性中樞神經系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）損傷中繼發(fā)損傷的重要因素，貫穿繼發(fā)損傷的始終。過去十多年隨著神經免疫學的發(fā)展，免疫反應在中樞神經系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究，但并未得出一致性的結論。傳統(tǒng)的觀點認為CNS是免疫豁免器官，任何浸潤其中的外周免疫細胞都是有害的，應當予以抑制以減輕繼發(fā)損傷[1]；而其它研究發(fā)現CNS損傷后主動或被動用CNS自身抗原免疫動物提高自身免疫T細

2、胞的數量和活性都能明顯增加損傷后神經元的存活，促進神經功能的恢復[2]，但具有這種保護作用的 T細胞的具體亞型仍不清楚。調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）是一類自然產生的能控制體內自身免疫反應的T細胞亞群，表達轉錄因子Foxp3，對自身抗原有很高的親和力，通過直接接觸或分泌抗炎因子IL-10，TGFβ等抑制T細胞的增殖和活化[3]。近年對調節(jié)性T細胞的研究主要集中在腫瘤和自身免疫性疾病中，CNS損傷后Treg

3、細胞的作用及其機制，以及其對于CNS損傷后免疫反應的作用如何尚不清楚。
　　免疫反應按參與的細胞和反應時序不同可分為固有免疫反應和適應性免疫反應，二者之間相互聯系，相互作用，共同維持機體內環(huán)境穩(wěn)定。巨噬細胞是機體一大類重要的固有免疫細胞，在損傷修復過程中起著重要的作用。CNS損傷后損傷區(qū)有兩種不同來源的巨噬細胞，一種是CNS固有的小膠質細胞活化產生，一種是血液單核細胞浸潤至損傷區(qū)產生，這兩種細胞在形態(tài)和表面標記上目前都無法區(qū)分，因

4、此被統(tǒng)稱為巨噬/小膠質細胞[4]，但它們在損傷后的具體作用是否完全一致仍有待研究。巨噬細胞在不同的細胞因子環(huán)境下能向不同方向極化，進而產生不同的作用。在LPS和IFN-γ存在的條件下細胞通過經典活化途徑向 M1方向活化，產生 TNFα和IL-1β等促炎因子，并高表達誘導型一氧化氮合梅（iNOS），產生大量氧自由基。而在IL-4和IL-13的作用下，細胞則向M2方向活化，產生IL-10和TGFβ等抗炎因子，并高表達精氨酸酶1（argina

5、se1）同iNOs競爭底物精氨酸，能促進細胞增殖和組織重塑[5]。研究顯示 CNS損傷后而 M2型活化的巨噬細胞有神經保護作用[6]。但具體是何種因素誘導和維持巨噬細胞的這種表型現在仍不清楚。
　　目的：
　　1.研究CNS損傷后的免疫反應類型；
　　2.研究調節(jié)性T細胞在CNS損傷中的作用及其機制；
　　3.觀察 CNS損傷后損傷區(qū)小膠質細胞來源的巨噬細胞和血液單核細胞來源的巨噬細胞之間的差異，及其對損傷恢復的

6、影響。
　　方法：
　　1.采用視神經夾傷模型，計數熒光金逆行標記的視網膜節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC），采用脊髓中度撞擊傷模型（100kDy），用BMS（Basso Mouse Scale）標準評估小鼠后肢運動功能恢復的情況；
　　2.給予地塞米松腹腔注射抑制免疫反應觀察其對 CNS損傷后神經元存活和神經功能恢復的影響，摘除CNS引流淋巴結，觀察其對視神經損傷后RGC存活的影響；3.流式

7、細胞術檢測 CNS損傷后不同淋巴結內 CD4+T細胞（CD45+TCRβ+CD4+），CD8+T細胞(CD45+TCRβ+CD8+)，調節(jié)性 T細胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3+)，效應T細胞（CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3-）的數量和比例；
　　4.清除調節(jié)性T細胞的方法：采用CD25單克隆抗體（克隆號：PC61）腹腔注射，或采用DEREG轉基因小鼠（在foxp3基因啟動子下帶有白喉毒素受

8、體基因）腹腔注射白喉毒素以清除表達foxp3和白喉毒素受體的調節(jié)性T細胞；
　　5.增加調節(jié)性T細胞的方法：尾靜脈回輸體外全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）和TGF-β誘導培養(yǎng)的調節(jié)性T細胞；
　　6.采用嵌合體小鼠（UBC-GFP小鼠的骨髓移植進輻照過的野生型小鼠體內，血液來源的細胞均表達GFP，而CNS固有的小膠質細胞不表達GFP），CCR2 KO小鼠以及CCR2-RFP轉基因小鼠觀

9、察CNS損傷區(qū)巨噬細胞arginase-1的表達情況；
　　7.免疫組織化學染色檢測損傷區(qū)CD4+T細胞，CD11b+巨噬細胞，Foxp3+細胞的數目，以及arginase-1的表達情況；
　　8. qPCR檢測損傷區(qū)炎癥因子，arginase-1，以及nos2等基因的表達情況；
　　結果：
　　1.視神經損傷后，頸深淋巴結內CD4+T細胞比例和數目均明顯增多而CD8+T細胞比例降低，頸深淋巴結內調節(jié)性T細胞和效

10、應T細胞的比例相對于損傷后皮膚引流淋巴結以及未損傷組的頸深淋巴結均升高。頸深淋巴結內CD4+T細胞IL-4表達增多，能促使體外培養(yǎng)的骨髓來源巨噬細胞表達arginase-1；
　　2.摘除頸深淋巴結小鼠視神經損傷后RGC存活明顯減少；地塞米松抑制免疫反應，其處理組視神經損傷后 RGC的存活明顯少于對照組，其脊髓損傷后后肢運動功能BMS評分也明顯低于對照組，
　　3.調節(jié)性T細胞對CNS損傷的作用有劑量差異效應，即用25μgP

11、C61抗體或4μg/kg白喉毒素少量清除調節(jié)性T細胞能明顯增加存活的神經元數目，而用250μg PC61或40μg/kg白喉毒素大量或完全清除調節(jié)性T細胞則產生相反的作用。實驗中神經元的存活同損傷區(qū)arginase-1的表達相關，即低劑量清除調節(jié)性T細胞使損傷區(qū)arginase-1的表達明顯增加，而大量清除調節(jié)性T細胞后視神經損傷區(qū)arginase-1的表達明顯減少；
　　4.靜脈回輸體外誘導培養(yǎng)的調節(jié)性T細胞能明顯減少視神經損傷

12、后視網膜節(jié)細胞的存活，同時其損傷區(qū)表達arginase-1的巨噬細胞比例減少，且損傷區(qū)抗炎因子IL-10的表達也明顯減少；
　　5.嵌合體小鼠CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1+的細胞大部分都為GFP+，CCR2 KO小鼠CNS損傷后損傷區(qū)缺乏arginase-1+的細胞，且CCR2-RFP小鼠脊髓損傷后損傷區(qū)arginase1+的細胞多為RFP+；
　　6. CCR2 KO小鼠在視神經損傷后視網膜節(jié)細胞的存活以及脊髓損

13、傷后運動功能的恢復方面均明顯差于野生型小鼠。
　　結論：
　　1. CNS損傷后外周的免疫反應主要發(fā)生在其引流淋巴結頸深淋巴結內，表現為以CD4+T細胞為主導的免疫反應，調節(jié)性T細胞和效應T細胞均有增加，并且這種免疫反應具有神經保護作用；
　　2.調節(jié)性T細胞對CNS損傷后的保護性免疫反應具有抑制作用，增加調節(jié)性T細胞能抑制免疫反應對CNS損傷的保護作用；而適當減少調節(jié)性T細胞的數目，減輕其對保護性免疫反應的抑制，能提

14、高CNS損傷后神經元的存活，但過分減少調節(jié)性T細胞可能使免疫反應過度活化而產生相反的作用，提示臨床上應用調節(jié)性 T細胞治療CNS損傷應尤為謹慎；
　　3. CNS損傷后調節(jié)性T細胞并不進入損傷區(qū)，而可能是在外周直接或間接作用于單核細胞，改變進入損傷區(qū)的單核巨噬細胞的極化狀態(tài)而發(fā)揮其作用的；
　　4. CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1主要表達在血源性單核細胞來源的巨噬細胞上，而小膠質細胞幾乎不表達arginase-1，且