調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　免疫炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）損傷中繼發(fā)損傷的重要因素，貫穿繼發(fā)損傷的始終。過去十多年隨著神經(jīng)免疫學(xué)的發(fā)展，免疫反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究，但并未得出一致性的結(jié)論。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為CNS是免疫豁免器官，任何浸潤其中的外周免疫細(xì)胞都是有害的，應(yīng)當(dāng)予以抑制以減輕繼發(fā)損傷[1]；而其它研究發(fā)現(xiàn)CNS損傷后主動或被動用CNS自身抗原免疫動物提高自身免疫T細(xì)

2、胞的數(shù)量和活性都能明顯增加損傷后神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[2]，但具有這種保護(hù)作用的 T細(xì)胞的具體亞型仍不清楚。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是一類自然產(chǎn)生的能控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，對自身抗原有很高的親和力，通過直接接觸或分泌抗炎因子IL-10，TGFβ等抑制T細(xì)胞的增殖和活化[3]。近年對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究主要集中在腫瘤和自身免疫性疾病中，CNS損傷后Treg

3、細(xì)胞的作用及其機(jī)制，以及其對于CNS損傷后免疫反應(yīng)的作用如何尚不清楚。
　　免疫反應(yīng)按參與的細(xì)胞和反應(yīng)時序不同可分為固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，二者之間相互聯(lián)系，相互作用，共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。巨噬細(xì)胞是機(jī)體一大類重要的固有免疫細(xì)胞，在損傷修復(fù)過程中起著重要的作用。CNS損傷后損傷區(qū)有兩種不同來源的巨噬細(xì)胞，一種是CNS固有的小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生，一種是血液單核細(xì)胞浸潤至損傷區(qū)產(chǎn)生，這兩種細(xì)胞在形態(tài)和表面標(biāo)記上目前都無法區(qū)分，因

4、此被統(tǒng)稱為巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞[4]，但它們在損傷后的具體作用是否完全一致仍有待研究。巨噬細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子環(huán)境下能向不同方向極化，進(jìn)而產(chǎn)生不同的作用。在LPS和IFN-γ存在的條件下細(xì)胞通過經(jīng)典活化途徑向 M1方向活化，產(chǎn)生 TNFα和IL-1β等促炎因子，并高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合梅（iNOS），產(chǎn)生大量氧自由基。而在IL-4和IL-13的作用下，細(xì)胞則向M2方向活化，產(chǎn)生IL-10和TGFβ等抗炎因子，并高表達(dá)精氨酸酶1（argina

5、se1）同iNOs競爭底物精氨酸，能促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織重塑[5]。研究顯示 CNS損傷后而 M2型活化的巨噬細(xì)胞有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。但具體是何種因素誘導(dǎo)和維持巨噬細(xì)胞的這種表型現(xiàn)在仍不清楚。
　　目的：
　　1.研究CNS損傷后的免疫反應(yīng)類型；
　　2.研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在CNS損傷中的作用及其機(jī)制；
　　3.觀察 CNS損傷后損傷區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和血液單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞之間的差異，及其對損傷恢復(fù)的

6、影響。
　　方法：
　　1.采用視神經(jīng)夾傷模型，計(jì)數(shù)熒光金逆行標(biāo)記的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC），采用脊髓中度撞擊傷模型（100kDy），用BMS（Basso Mouse Scale）標(biāo)準(zhǔn)評估小鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)的情況；
　　2.給予地塞米松腹腔注射抑制免疫反應(yīng)觀察其對 CNS損傷后神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，摘除CNS引流淋巴結(jié)，觀察其對視神經(jīng)損傷后RGC存活的影響；3.流式

7、細(xì)胞術(shù)檢測 CNS損傷后不同淋巴結(jié)內(nèi) CD4+T細(xì)胞（CD45+TCRβ+CD4+），CD8+T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD8+)，調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3+)，效應(yīng)T細(xì)胞（CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3-）的數(shù)量和比例；
　　4.清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法：采用CD25單克隆抗體（克隆號：PC61）腹腔注射，或采用DEREG轉(zhuǎn)基因小鼠（在foxp3基因啟動子下帶有白喉毒素受

8、體基因）腹腔注射白喉毒素以清除表達(dá)foxp3和白喉毒素受體的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
　　5.增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法：尾靜脈回輸體外全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）和TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
　　6.采用嵌合體小鼠（UBC-GFP小鼠的骨髓移植進(jìn)輻照過的野生型小鼠體內(nèi)，血液來源的細(xì)胞均表達(dá)GFP，而CNS固有的小膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)GFP），CCR2 KO小鼠以及CCR2-RFP轉(zhuǎn)基因小鼠觀

9、察CNS損傷區(qū)巨噬細(xì)胞arginase-1的表達(dá)情況；
　　7.免疫組織化學(xué)染色檢測損傷區(qū)CD4+T細(xì)胞，CD11b+巨噬細(xì)胞，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞的數(shù)目，以及arginase-1的表達(dá)情況；
　　8. qPCR檢測損傷區(qū)炎癥因子，arginase-1，以及nos2等基因的表達(dá)情況；
　　結(jié)果：
　　1.視神經(jīng)損傷后，頸深淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)目均明顯增多而CD8+T細(xì)胞比例降低，頸深淋巴結(jié)內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效

10、應(yīng)T細(xì)胞的比例相對于損傷后皮膚引流淋巴結(jié)以及未損傷組的頸深淋巴結(jié)均升高。頸深淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞IL-4表達(dá)增多，能促使體外培養(yǎng)的骨髓來源巨噬細(xì)胞表達(dá)arginase-1；
　　2.摘除頸深淋巴結(jié)小鼠視神經(jīng)損傷后RGC存活明顯減少；地塞米松抑制免疫反應(yīng)，其處理組視神經(jīng)損傷后 RGC的存活明顯少于對照組，其脊髓損傷后后肢運(yùn)動功能BMS評分也明顯低于對照組，
　　3.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CNS損傷的作用有劑量差異效應(yīng)，即用25μgP

11、C61抗體或4μg/kg白喉毒素少量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能明顯增加存活的神經(jīng)元數(shù)目，而用250μg PC61或40μg/kg白喉毒素大量或完全清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則產(chǎn)生相反的作用。實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)元的存活同損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)相關(guān)，即低劑量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)明顯增加，而大量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后視神經(jīng)損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)明顯減少；
　　4.靜脈回輸體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能明顯減少視神經(jīng)損傷

12、后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活，同時其損傷區(qū)表達(dá)arginase-1的巨噬細(xì)胞比例減少，且損傷區(qū)抗炎因子IL-10的表達(dá)也明顯減少；
　　5.嵌合體小鼠CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1+的細(xì)胞大部分都為GFP+，CCR2 KO小鼠CNS損傷后損傷區(qū)缺乏arginase-1+的細(xì)胞，且CCR2-RFP小鼠脊髓損傷后損傷區(qū)arginase1+的細(xì)胞多為RFP+；
　　6. CCR2 KO小鼠在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活以及脊髓損

13、傷后運(yùn)動功能的恢復(fù)方面均明顯差于野生型小鼠。
　　結(jié)論：
　　1. CNS損傷后外周的免疫反應(yīng)主要發(fā)生在其引流淋巴結(jié)頸深淋巴結(jié)內(nèi)，表現(xiàn)為以CD4+T細(xì)胞為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞均有增加，并且這種免疫反應(yīng)具有神經(jīng)保護(hù)作用；
　　2.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CNS損傷后的保護(hù)性免疫反應(yīng)具有抑制作用，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制免疫反應(yīng)對CNS損傷的保護(hù)作用；而適當(dāng)減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目，減輕其對保護(hù)性免疫反應(yīng)的抑制，能提

14、高CNS損傷后神經(jīng)元的存活，但過分減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能使免疫反應(yīng)過度活化而產(chǎn)生相反的作用，提示臨床上應(yīng)用調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞治療CNS損傷應(yīng)尤為謹(jǐn)慎；
　　3. CNS損傷后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并不進(jìn)入損傷區(qū)，而可能是在外周直接或間接作用于單核細(xì)胞，改變進(jìn)入損傷區(qū)的單核巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)而發(fā)揮其作用的；
　　4. CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1主要表達(dá)在血源性單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞上，而小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)arginase-1，且