體外誘導毛囊Bulge細胞向皮脂腺細胞定向分化的研究.pdf

1、毛囊是皮膚重要的附屬器官，具有周期性生長的特點。目前已知毛囊干細胞位于外根鞘的隆突(bulge)區(qū)，研究證明毛囊bulge細胞具有多向分化的能力，不僅能分化形成毛囊，還能夠形成皮脂腺和表皮角朊細胞。由于表皮、毛囊和皮脂腺關系密切，一般將三者統(tǒng)歸為表皮-毛囊-皮脂腺單位(epidermo-piosebaceousunit)或表皮和毛囊皮脂腺單位(piosebaceousunit)。 皮脂腺(sebaceousgland)是皮膚重要

2、的附屬結構，具有抗炎、抵抗外來微生物的作用；它能夠抗氧化，特別是抗紫外線的侵襲，對保持皮膚的完整和功能正常有著重要的作用。皮脂腺細胞的發(fā)育分化過程十分復雜，包括細胞形態(tài)的改變和基因表達的變化。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor，PPA腳)在成脂細胞分化過程中起著關鍵的作用，它能有效促進脂質合成。在PPARγ的三種亞型中，PPARγ2與脂肪和皮脂腺細胞的分化尤其相

3、關。PPARγ2是脂肪細胞分化過程中重要的調節(jié)因子，它可促使成纖維細胞或骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化。 盡管多項證據(jù)表明皮脂腺的更新和維持來源于毛囊的Bulge細胞，但是，至今仍未在體外實驗中觀察到bulge細胞分化為皮脂腺細胞的直接證據(jù)。毛囊干細胞體外分離培養(yǎng)技術的相對滯后，影響了研究的進一步深入。我們在體外分離培養(yǎng)了毛囊bulge細胞，并在一定的條件下誘導bulge細胞向皮脂腺細胞定向分化，同時構建PPARγ2質粒，通過脂

4、質體將其轉染到bulge細胞中，觀察它對bulge細胞定向分化為皮脂腺過程中的作用。主要結果如下： 1、毛囊bulge細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性的研究 采用免疫組化及原位雜交技術，檢測大鼠毛囊Bulge區(qū)細胞干細胞表面標志物和分化標志物的表達情況，運用顯微分離及酶消化法分離并培養(yǎng)大鼠毛囊Bulge細胞，觀察培養(yǎng)的毛囊bulge細胞體外生長特性，同時比較了不同培養(yǎng)體系對bulge細胞生物學特性的影響。結果發(fā)現(xiàn)：(1)干細胞

5、表面標志物K19的表達主要位于毛囊的Bulge區(qū)，而該區(qū)不表達毛囊上皮的細胞分化標志K10。(2)經(jīng)酶消化后的毛囊Bulge區(qū)組織易貼壁，24h后即有細胞爬出，沿Bulge區(qū)向外擴展生長，3-4天后細胞出現(xiàn)融合，細胞在培養(yǎng)6～7天細胞數(shù)量達峰值，以后細胞生長減慢，傳代后細胞成克隆生長，生長良好，細胞形態(tài)均一，呈鋪路石狀，核漿比例大，表現(xiàn)出原始細胞形態(tài)的特征。(3)免疫細胞化學檢測，群集生長的毛囊Bulge細胞表達K19，運用免疫熒光雙標

6、方法檢測細胞α6整聯(lián)蛋白和CD71的表達，該干細胞強表達α6整聯(lián)蛋白，而CD71表達較弱。傳代后及隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的K19陽性表達逐漸減弱，陽性細胞逐漸減少。(4)觀察第一代無血清KSFM培養(yǎng)基中的bulge細胞的生長曲線與含血清的DMEM培養(yǎng)基無明顯差異，但是比較不同代次間bulge細胞克隆形成率和K19陽性率，無血清KSFM組明顯優(yōu)于含血清的DMEM組。因此，對比傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系，本實驗采用低鈣無血清培養(yǎng)體系對保持bulge細

7、胞的生物學特性更為有效。 2、體外誘導毛囊bulge細胞向皮脂腺定向分化的初步研究 本部分我們觀察了大鼠毛囊bulge細胞在體外誘導環(huán)境下向皮脂腺細胞定向分化的能力，體外分離培養(yǎng)大鼠毛囊bulge細胞，然后在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細胞的分化情況。結果發(fā)現(xiàn)：(1)光鏡下可以觀察到，bulge細胞開始培養(yǎng)時體積小、核大，核仁明顯，細胞器少，呈現(xiàn)典型的原始細胞形態(tài)。隨后細胞逐漸出現(xiàn)分化，胞體增大，細胞略呈圓形，胞漿豐富，胞漿與

8、核的比例增大。進一步培養(yǎng)，可見一些細胞的核周圍內有少量脂滴合成。誘導培養(yǎng)3周左右，核周的脂滴逐漸增多，形態(tài)類皮脂腺細胞結構。同期培養(yǎng)的毛囊bulge細胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。(2)光鏡下觀察，誘導三周后毛囊bulge油紅O染色陽性，可以見到脂滴為鮮紅色，排列于胞核周圍，免疫細胞化學檢測誘導后細胞表達EMA。(3)免疫細胞化學檢測結果顯示，經(jīng)過誘導培養(yǎng)的毛囊bulge細胞表達PPARγ蛋白，陽性信號為棕黃色，主要位于胞漿，同期培養(yǎng)的毛囊bulge

9、細胞表達弱陽性。 3、PPARγ2載體的構建及GFP標記在毛囊bulge細胞中表達 用基因克隆方法，成功構建了pEGFP-PPARγ2真核表達載體，然后轉染毛囊bulge細胞。結果發(fā)現(xiàn)：(1)倒置顯微鏡下觀察，轉染后的細胞穩(wěn)定表達綠色熒光，為下一步實驗奠定了基礎。(2)免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，轉染后的細胞表達PPARγ蛋白，陽性信號為棕黃色，主要位于胞漿。 4、PPARγ2促毛囊bulge細胞向皮脂腺細胞定向分化

10、 本部分采用免疫組化、質粒轉染、RT-PCR及油紅O染色等方法觀察了PPARγ2對毛囊bulge細胞向皮脂腺分化的影響。結果如下：(1)免疫組化結果顯示，PPARγ在成人全毛囊中均有表達，其中毛囊內根鞘、皮脂腺陽性最強，bulge區(qū)也有表達，但是信號較弱。在大鼠中主要表達于毛囊內根鞘和皮脂腺，在bulge上部靠近皮脂腺區(qū)也有表達。免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的毛囊bulge細胞弱表達PPARγ。(2)光鏡下可以觀察到，bulge-P

11、PARγ2細胞誘導培養(yǎng)3周左右，核周的脂滴逐漸增多，形態(tài)類皮脂腺細胞結構，油紅O染色示脂滴為鮮紅色，集中于胞核周細胞表達皮脂腺的標志EMA，陽性信號為棕色，主要位于胞漿。bulge-mock細胞形態(tài)和實驗組類似但未見脂滴的合成。(3)bulge-PPARγ2的油紅O染色陽性率明顯高于未轉染質粒組細胞，雖然EMA陽性率差別不如油紅O陽性率明顯，但可以看到轉染PPARγ2質粒組細胞的陽性強度高于未轉染質粒組細胞。(4)我們檢測了PPARγ2