par-4蛋白對端粒酶活性影響的研究.pdf

1、目的:探討腫瘤組織和正常組織中par-4 (prostate apoptosis response-4) 蛋白與hTERT蛋白表達和端粒酶活性表達的相關關系,以及檢測正、反義par-4基因轉染不同體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的生物學特性、par-4基因表達、hTERT蛋白和端粒酶活性,探討par-4蛋白影響端粒酶活性的可能機制,為進一步深入研究端粒酶活性調控提供線索.方法:1. 收集肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌組織標本共46例,以及每一癌組織

2、標本中相應正常組織共46例.分別用免疫組化染色法、western blot法、RT-PCR法檢測所有組織中par-4基因的表達情況,同時用上述各種方法檢測癌組織中hTERT的表達情況,用PCR-ELISA法檢測癌組織的端粒酶活性,并且運用統(tǒng)計學分析表達與hTERT表達和端粒酶活性的相關關系.2. 應用分子克隆技術,構建par-4基因正義真核表達載體和par-4基因反義表達載體.用脂質體介導轉染法將par-4基因正義、反義基因真核表達載體

3、(pClneo-par-4, pcDNA3.1(-)-par-4)和兩種空質粒載體(pc1-neo、pcDNA3.1(-))分別轉入體外培養(yǎng)的胃癌細胞株SGC7901,肺腺癌細胞株A549,結腸癌細胞株HCT-116細胞和肝癌細胞HepG-2中,用G418篩選陽性轉染細胞克隆后,對轉染前后各株細胞的生物學特性、生長曲線進行觀察,用免疫組化染色法、western blot定量檢測法、RT-PCR半定量檢測法以及PCR-ELISA法對各株細

4、胞的par-4表達、hTERT表達、端粒酶活性進行定性、定量檢測,統(tǒng)計學分析以上各檢測指標的相關關系.結果:1. Par-4蛋白廣泛表達于肺、胃、肝、結腸、直腸等組織中,在腫瘤組織中也是普遍表達的,但是在腫瘤組織中,表達水平與相應的正常組織相比明顯降低,有顯著性差異.2. 在正常組織中,par-4主要表達于腺體細胞中、血管上皮細胞和成纖維細胞中.在細胞中的分布主要表達于胞漿,可以見到在少數(shù)胞核中有表達,但仍以胞漿表達占多數(shù).3. hTE

5、RT表達與端粒酶活性在癌組織和體外培養(yǎng)細胞中均表現(xiàn)出一致性.4. 成功構建了par-4基因的正義和反義基因真核表達載體pClneo-par-4和pcDNA3.1(-)-par-4.5.將正、反義par-4真核表達載體轉染入肺腺癌細胞株A549,胃癌細胞株SGC-7901,肝癌細胞HepG-2和結腸癌細胞株HCT-116細胞等4種體外腫瘤細胞中,且有效表達,pClneo-par-4轉染細胞中par-4 mRNA和蛋白表達水平均升高,平均到

6、達2-3倍,反義表達載體pcDNA3.1(-)-par-4轉染的細胞中,par-4 mRNA和蛋白表達水平均降低,降低到原來的20﹪~30﹪,反義基因的封閉效果達70﹪~80﹪.6. 經G418篩選獲得的陽性克隆中,穩(wěn)定轉染正義表達載體pClneo-par-4的形態(tài)和生長速度沒有明顯的改變;而穩(wěn)定轉染反義表達載體pcDNA3.1(-)-par-4的細胞A549、HepG2、HCT-116出現(xiàn)生長速度減慢.7. Par-4蛋白表達與hTE

7、RT表達和端粒酶活性未見明確相關性.結論:1. Par-4蛋白在正常組織中廣泛表達,在癌組織中表達有明顯減低,與正常組織相比,有顯著性差異,par-4表達降低與腫瘤是密切相關的.2. 成功構建了par-4基因的正義和反義真核表達載體pClneo-par-4和pcDNA3.1(-)-par-4,成功的將外源性基因轉染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞,并有效表達,增加或減少par-4蛋白的表達.3. Par-4蛋白的表達與hTERT的表達和端粒酶的活性