異氟烷預處理在鼠腦缺血再灌注損傷中線粒體介導保護機制的探討.pdf

1、預處理(preconditioning，PC)作為機體內源性保護現(xiàn)象，在臨床上越來越受到人們關注，由于缺血其本身是傷害性應激過程，對機體是一種創(chuàng)傷，使缺血預處理(ischemicpreconditioning，IPC)在臨床上的應用受到限制；因此，藥物預處理則具有更重要的臨床意義。 自1997年兩個麻醉研究組Cason和Kersten首次分別報導了異氟烷模擬預處理作用以來，圍繞麻醉藥預處理(anestheticprecondit

2、ioning，APC)對心肌缺血再灌注損傷進行很多研究，雖其作用機制仍尚有諸多爭論，但近年來的研究認為APC與IPC作用機制相似，目前認為線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitochondrialadenosinetriphosphate-sensitivepotassiumchannel，mitoKATP)是APC作用的靶點。研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥預處理(volatileanestheticpreconditioning，VAPC)的心肌保

3、護作用與mitoKATP開放有關。 神經細胞內含有大量的mitoKATP，甚至是心肌的3～7倍，同時發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥不僅促進mitoKATP開放，還具有抑制血小板聚集及白細胞粘附作用，但mitoKATP開放前的信號傳導及開放后如何對神經細胞產生保護作用尚不清楚。所以，VAPC對腦缺血損傷的作用機制尚待研究。 線粒體是一個結構和功能復雜而敏感的重要細胞器，研究表明缺血引起細胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體通

4、透性轉運通道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)參與了神經損傷，并且是缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)所致腦細胞損傷的關鍵部位。在細胞凋亡過程中的多個關鍵性步驟都涉及線粒體。有報道證實凋亡能夠加重缺血性腦損傷的程度，且抗凋亡蛋白如Bcl-2阻止參與凋亡蛋白的過度表達，從而減輕腦缺血性損傷。反之，降低Bcl-2的表達則加重腦損傷。當MPTP與促凋亡蛋白B

5、ax結合后，MPTP開放，釋放細胞色素C(cytochromec，cytC)及凋亡誘導因子(apotosisinducingfactor，AIF)等物質，與Bax作用相反，抑制凋亡蛋白Bcl-2可阻止MPTP與Bax結合及其選擇性通道的形成，阻斷凋亡通路。 吸入麻醉藥異氟烷(isoflurane，ISO)預處理是否通過線粒體介導的凋亡途徑產生腦保護作用尚不清楚。本實驗旨在通過沙士鼠腦I/R模型探討異氟烷預處理作用的線粒體介導的細

6、胞凋亡機制，以及是否通過一氧化氮(nitricoxide，NO)信號傳導，更好地揭示吸入麻醉藥預處理的腦保護作用及其機制。本研究分三部分：第一、異氟烷預處理對鼠腦缺血再灌注線粒體超微結構和通透性轉運通道的影響；第二、異氟烷預處理對缺血再灌注損傷Bcl-2和Bax的mRNA在鼠腦組織中表達的影響；第三、異氟烷預處理對鼠腦缺血再灌注作用的一氧化氮信號傳導的探討。 實驗材料和方法：一、實驗材料1.實驗動物：健康雄性蒙古沙士鼠99只，體

7、重55～85g2.主要試劑及藥品：ISO(雅培公司)，5-HD(5-羥基葵酸鹽)、AG(氨基胍)、Fura-2/AM、EGTA(sigma公司)，牛血清白蛋白(北京紅星生物化學制品廠)，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒(上海華美生物工程公司)，TakaRa試劑盒(大連寶生物公司)，DNAMARKERDL-2000(大連博瑞得生物技術有限責任公司)，Primer引物合成試劑盒(上海博亞生物技術有限公司) 3.主要實驗器材：Date

8、x氣體濃度監(jiān)測儀(CapnomacUltima芬蘭)，850型日立熒光分光光度計(日本)，1601島津紫外分光光度計(日本)，DF15D高速冷凍離心機(日本日立)，JEM-1200EX透射電鏡(美國)，LKB-V型超薄切片機，KODAKID型凝膠成象分析系統(tǒng)(美國)，PTR-100PCR擴增儀(美國) 二、實驗方法1.ISO預處理：將鼠置于100cm×100cm×100cm的實驗艙里，艙內放入ISO，使ISO濃度維持在1.2％～

9、1.5％。 2.腦I/R模型：10％水合氯醛0.35gkg-1腹腔注射麻醉，頸正中切口，暴露雙側頸總動脈用無創(chuàng)微動脈夾夾閉5min后再開放，24h后迅速取前腦。 3.實驗分組：SHAM組：假手術組，只分離雙側頸總動脈而未予夾閉。 IR組：用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5min后再開放24h。 ISO組：ISO預處理組，I/R前60minISO預處理30min，后在空氣中30min。 5-HD+IS

10、O組：5-HD(mitoKATP特異性阻滯藥)10mgkg-1腹腔內注射，30min后同ISO組。 5-HD組：L/R前30min5-HD10mgkg-1腹腔內注射。 AG+ISO組：AG(誘導型NO合酶抑制劑)200mgkg-1腹腔內注射，30min后同ISO組。 AG組：L/R前30minAG200mgkg-1腹腔內注射。 4.觀察指標和測定方法1)線粒體懸浮液制備：低溫差異法分離線粒體，用分離介質制

11、成懸浮液。 2)線粒體超微結構觀察(電鏡)3)線粒體Ca2+濃度的測定：根據(jù)Mccormack方法改進。以Fura-2/AM為Ca2+熒光指示劑，用日本850型日立熒光分光光度計測定線粒體Ca2+濃度。發(fā)射波長510nm，以430nm激發(fā)光譜掃描。 4)MPTP的測定：利用MPTP增大時線粒體膜內外滲透失衡，導致吸光度明顯減少的原理。反應條件為25℃、pH=7.4、線粒體蛋白濃度為0.5mgml-1。反應體系加入150μ

12、molL-1Ca2+為激發(fā)劑，在540nm波長處每分鐘記錄吸光度的變化(△S值)。 5)腦組織凋亡相關基因Bcl-2和Bax的mRNA表達變化(RT-PCR法) 結論：1.異氟烷預處理能夠減輕沙士鼠腦I/R引起的線粒體Ca2+超載。 2.異氟烷預處理對鼠腦I/R的保護作用是由抑制MPTP的開放介導的。 3.異氟烷預處理能誘導鼠腦組織中抗凋亡基因Bcl-2表達上調及促凋亡基因Bax表達下調。 4.異