抗LMP1單鏈抗體-魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構建、表達及生物活性研究.pdf

1、[目的] 體外拼裝抗?jié)摲さ鞍?(Latent membrane protein-1，LMP1)單鏈抗體(singlechain variable fragment，scFv)/魚精蛋白截短體(truncated protamine，tP)融合蛋白基因(anti-LMP1 scFv/tP)，在大腸桿菌中誘導表達、純化和復性anti-LMP1 scFv/tP融合蛋白，并對復性產(chǎn)物的抗原結合活性和DNA結合活性進行研究。 [

2、方法] 在抗LMP1單鏈抗體基因的3’末端連接上編碼魚精蛋白截短體的基因序列，設計抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因。根據(jù)表達載體pET-32a(+)的限制性酶切位點，在融合蛋白基因的5’和3’末端設計EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。在DNAWORKS程序指導下將融合基因設計成22條相互互補的寡核苷酸序列，采用PCR為基礎的基因拼接獲得抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因。將融合蛋白基因亞克隆至pMD18-

3、T simple克隆載體中，經(jīng)過酶切鑒定和測序驗證；進一步將序列完全正確的融合蛋白基因克隆至原核表達載體pET-32a(+)。在大腸桿菌Rosseta中誘導表達抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和western blot驗證。以包涵體形式表達的融合蛋白在變性條件下進行純化，然后通過尿素濃度梯度透析復性的方法進行復性。間接免疫熒光染色檢測復性融合蛋白與相應抗原LMP1的結合活性，DNA凝膠遷移阻滯實驗檢

4、測復性融合蛋白與DNA的結合活性。 [結果] 各寡核苷酸片段經(jīng)過兩輪PCR擴增后可見明顯的產(chǎn)物帶，產(chǎn)物T-A克隆后，經(jīng)酶切和測序鑒定，獲得序列完全正確的抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因，成功構建了抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白原核表達載體。轉化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導培養(yǎng)，SDS-PAGE和western blot證實融合蛋白成功表達。變性融合蛋白通過Ni2+親合層析介質得到有效純

5、化，尿素濃度梯度透析成功復性了融合蛋白。間接免疫熒光染色結果表明復性的融合蛋白具有抗原結合活性，能與LMP1表達陽性的CNEl-GL細胞結合，而不能與LMP1表達陰性的CNE1細胞結合；DNA凝膠遷移阻滯試驗結果提示復性的融合蛋白具有DNA結合活性。 [結論] 在DNAWORKS程序指導下設計寡核苷酸序列并進行體外基因拼裝是獲得目的基因的有效方法；抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因在大腸桿菌Rosseta中誘