姜黃素聯(lián)合表柔比星對HepG2細胞中PI3K-AKT信號通路和FOXP3及TIPE2的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌（肝癌）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國又是肝癌的高發(fā)區(qū)。肝癌起病隱匿，發(fā)展快，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，失去了手術(shù)機會。射頻消融，肝動脈介入化療栓塞，無水酒精注射等治療手段臨床療效亦不理想。肝癌組織和肝癌細胞對我們常用的化療藥物如表柔比星、絲裂霉素、5-FU、順鉑等不敏感，化療的效果較差。中醫(yī)中藥可抑制腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。姜黃素是從姜黃的根莖中提取的活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、預(yù)防和抑制腫

2、瘤生長的作用，而且研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對腫瘤患者具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。姜黃素聯(lián)合現(xiàn)有的常用的化療藥物對肝癌細胞生長抑制作用和對免疫功能的調(diào)節(jié)作用目前尚不十分清楚。
　　 腫瘤壞死因子-α誘導蛋白-8樣分子2(Tumornecrosisfactor-alpha-inducedprotein-8like-2，TNFAIP8L2，TIPE2)是新近發(fā)現(xiàn)的重要的免疫分子，不僅可以負性調(diào)控獲得性免疫和固有免疫，而且被視為細胞免疫的重要調(diào)節(jié)者。

3、同時具有溝通炎癥和腫瘤的橋梁的作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。FOXP3(forkheadboxP3，F(xiàn)OXP3)是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，主要表達在調(diào)節(jié)性T細胞上，近年研究發(fā)現(xiàn)FOXP3亦可以表達在腫瘤細胞中，具有促使腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)督的作用。但他們在腫瘤細胞中的表達及對腫瘤細胞的影響的研究尚不多見。
　　 近年來發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物表柔比星不僅可以促進腫瘤細胞的凋亡，而且可以通過調(diào)節(jié)多種免疫細胞和免疫分子影響

4、抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用，但對肝癌細胞的抑制作用尚不令人滿意，因此尋找有效的抑制肝癌細胞生長的藥物和方法成為科研工作者的重點。人類的多種腫瘤如胃癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌、腎癌都與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threoninekinase，AKT)信號通路密切相關(guān)。這條通路不但可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的炎癥因

5、子的表達，而且研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路還可以通過調(diào)節(jié)免疫分子干預(yù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，我們通過體外培養(yǎng)HepG2肝癌細胞，單獨應(yīng)用表柔比星及聯(lián)合姜黃素對HepG2細胞進行干預(yù)，觀察這些藥物對HepG2細胞生存率，細胞中FOXP3，TIPE2表達及對PI3K/AKT信號通路分子的影響，來探討表柔比星單用或聯(lián)合姜黃素應(yīng)用是否可以影響TIPE2，F(xiàn)OXP3表達及對PI3K/AKT信號通路的影響，并探討其分子機制。
　　 目

6、的:研究表柔比星單用或聯(lián)合姜黃素應(yīng)用對HepG2肝癌細胞生長的影響及對PI3K/AKT信號通路和相關(guān)分子TIPE2和FOXP3的影響，并探討其分子機制。
　　 方法:體外培養(yǎng)HepG2用于研究，取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，培養(yǎng)48小時后給予不同濃度姜黃素5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、80μmol/L進行藥物干預(yù)，分別在24、48小時終止干預(yù)，并采用M

7、TT方法檢測細胞的存活率，確定姜黃素起作用的最低濃度為20μmol/L。給予不同濃度表柔比星1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μgm/L進行藥物干預(yù)，分別在24、48小時終止干預(yù)，確定表柔比星起作用的最低濃度為2μg/mL。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，分為對照組，表柔比星組（2μg/mL）、姜黃素（20μmol/L）聯(lián)合表柔比星（2μg/mL）組，以同樣的方法干預(yù)HepG2細胞，分別在24、48小時采用MT

8、T方法檢測細胞的存活率;取對數(shù)生長期細胞分為對照組、表柔比星組和姜黃素組，以同樣的方法和濃度的干預(yù)HepG2細胞提取細胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用RT-PCR方法檢測HepG2細胞中TIPE2、PTEN、AKT、NF-κB、FOXP3的表達;應(yīng)用Western-blot方法檢測HepG2細胞中PTEN和AKT蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、姜黃素、表柔比星及表柔比星聯(lián)合姜黃素對HepG2細胞生長和存活的影響:
　

9、　 MTT結(jié)果顯示:隨著姜黃素濃度和干預(yù)時間的增加，HepG2細胞的存活率逐漸下降，姜黃素濃度為5μmol/L和10μmol/L時，HepG2細胞存活率下降并不明顯，濃度為20μmol/L細胞生存率開始迅速下降，因此確定20μmol/L為姜黃素最低有效濃度。24和48小時時姜黃素5μmol/L和姜黃素10μmol/L，姜黃素40μmol/L和姜黃素50μmol/L相比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，各時間點內(nèi)其余各組間比較，P＜0

10、.05，差異有統(tǒng)計學意義。表柔比星亦抑制HepG2細胞的生長，隨著表柔比星干預(yù)的濃度和時間的增加，細胞的生存率也呈下降趨勢，確定表柔比星2μg/ml為最低有效濃度。表柔比星不同濃度各時間點內(nèi)各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。而且MTT結(jié)果顯示表柔比星2μg/ml聯(lián)合姜黃素20μmol/L較單用表柔比星組細胞存活率明顯下降P＜.0.05，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2、表柔比星單獨及聯(lián)合姜黃素對HepG2細胞中

11、TIPE2、PTEN、AKT、NF-KB及FOXP3mRNA及PTEN、AKT蛋白影響:
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:表柔比星組與對照組比較，表柔比星組AKT、NF-KB和FOXP3mRNA的表達下降（P＜0.05），PTEN和TIPE2mRNA的表達上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計學差異;姜黃素聯(lián)合表柔比星組和表柔比組相比較，聯(lián)合組AKT、NF-κB和FOXP3mRNA表達下降(P＜0.05)，PTEN和TIPE2mRNA

12、的表達上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計學差異。
　　 Western-blot結(jié)果顯示:表柔比星組與對照組比較，表柔比星組AKT蛋白表達下降(P＜0.05)，PTEN蛋白表達上升（P＜0.05），二組之間有統(tǒng)計學差異。姜黃素聯(lián)合表柔比星組和表柔比組相比較，聯(lián)合組AKT蛋白表達下降（P＜0.05），PTEN蛋白表達上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、姜黃素及表柔比星以濃度和時間